книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза
.pdfцитохромов Ъ и /. Тем не менее попытки добиться вымывания цитохромов группы b из такого осадка при использовании широ кого спектра солевых растворов или смесей с органическими рас творителями оказались пока безуспешными. Инкубация суспен зии осадка в фосфатном буфере нейтрального рН с равным объ емом 10%-ного холата приводит к частичной солюбилизации только Цит f, но не цитохромов группы Ь.
Из наших опытов можно было сделать вывод, что обработка хлоропластов ацетоном, хотя и нарушает нативную структуру ламелл, вызывает частичную денатурацию цитохромов. Цит b в составе осадка сохранял способность к окислительно-восста новительным превращениям, но терял способность к растворе нию. Не удалось также перевести Цит b в раствор при примене нии бутанола, фенола, петролейного эфира, серного эфира, и его смеси с этанолом.
Действие гидролаз. Обработка хлоропластов гидролитичес кими ферментами не получила признания как метод выделения пигмент-белковых комплексов, в отличие от применения детер гентов, и лишь эпизодически используется для разрушения хло
ропластов. Обычно |
гидролазы применяют |
для |
изучения |
строе |
|
ния хлоропластов, |
а также в отдельных случаях для исследова |
||||
ния ЭТЦ. Приведем примеры таких работ. |
|
|
|
||
Инкубация |
с липазой уменьшает дихроизм |
хлоропластов, а |
|||
с протеазой— |
увеличивает. На основании |
этих данных, |
Томас |
иХардвельд [904] сделали вывод, что молекулы хлорофилла окружены липидным слоем, который разрушается липазой, в ре зультате чего ориентация молекул хлорофилла может несколько нарушаться. Протеаза, наоборот, изменяет форму липопротеидов,
ипри частичном разрушении ламелл происходит «уплощение» липопротеидов. В результате дихроизм при обработке трипсином увеличивается.
Мантаи [707] сообщил о применении трипсина для изучения ЭТЦ хлоропластов. Изменение спектров низкотемпературной флуоресценции хлоропластов шпината при их обработке липазой и протеазой наблюдал Брил [270, 271]. В этих случаях происхо дило начальное усиление реакции Хилла, вызванное, вероятно, разобщением, но затем фермент ингибировал транспорт элект ронов.
Островская с сотр. [99, 101], изучая влияние галактолипазы, папаина и трипсина на спектральные и фотохимические свойства хлоропластов гороха, сравнивала изменение этих свойств в обо гащенных ФС-1 и ФС-П частицах после их выделения путем ин кубации с дигитонином. Установлена, в частности, роль галактолипидов в организации ПБЛВ-комплекса, относящегося к ФС-1, но не к ФС-П.
Ввиду неспецифичности действия гидролаз едва ли в бли жайшее время следует ожидать важных результатов от их при-
менения в выделении ПБЛВ-комплексов, в особенности комплек сных препаратов протеаз, например проназы из Bacillus subtilis. Наоборот, применение тонко и точно действующих гидролаз, вы деляемых из змеиных ядов, например фосфолипазы из яда коб ры, весьма перспективно. Однако отчетов о законченных исследо ваниях с применением такой обработки для выделения ПБЛВкомплексов пока нет.
Описанные выше приемы с использованием неводных раство рителей, детергентов или гидролаз для выделения ПБЛВ-комп лексов в большей или меньшей степени изменяют нативные ПБЛВ-комплексы. Попытки избежать такого рода воздействий с помощью разрушения хлоропластов физическими методами'за служивают особого внимания, однако разработка этих методов находится в начальной стадии. Поэтому следует сделать общий вывод, что проблема выделения нативных ПБЛВ-комплексов остается до конца не решенной. С этим отчасти связано отсут ствие в литературе однозначного, сколько-нибудь четкого опре
деления понятия «пигмент-белковый |
комплекс». |
Исследователи |
н авторы соответствующих обзоров чаще всего |
вообще избега |
|
ют давать определения [718, 321, 425, |
426, 76]. |
|
Искусственные пигмент-белковые комплексы. В общее поня тие «пигмент-белковые комплексы» включают также искусствен ные образования, создаваемые соединением хлорофилла из од ного источника с белками (илипидами) из других источников. Ис кусственные пигмент-белковые комплексы начали создавать еще до того, как были достигнуты первые успехи на пути выделения естественных пигмент-белковых комплексов из хлоропластов.
Одними из таких работ раннего периода являются исследова ния Вишняка [39, 949] фотохимических и энзиматических свойств комплекса, полученного добавлением спиртового раство ра хлорофилла к экстрагированному ацетоном хлоропластному материалу. Вишняк, наблюдая (в атмосфере гелия) восстанов ление окисленного глутатиона в присутствии глутатионредуктазы и НАДФ+, пришел к заключению, что восстановление глу татиона может служить мерой восстановления НАДФ+. Фото химическая активность измерялась также по уменьшению редокс-потенциала при включении света. (Очень важно, что про кипяченные или подвергнутые замораживанию экстракты не бы ли эффективными. Поэтому реконструированная система в дан ном случае включала фотохимический и энзиматический меха низмы. Часто исследователи забывают о подобном контроле, что существенно снижает ценность полученных ими результатов). В опытах Вишняка не было получено данных о том, что донором электронов является вода. Вероятнее всего, донорами электро нов служили другие компоненты экстракта.
Уолкен [1009] добавлял 85%-ный ацетоновый раствор пиг ментов из хлоропластов к различным белковым растворам. До бавление желатина, бычьего сывороточного альбумина или
Y-глобулина вызывало образование комплексов. Спектры этих комплексов сравнивались со спектрами иативных хлоропластов.
В лаборатории Красновского в течение многих лет изучают ся различные фотохимические модели, в том числе модели с белками [65, 67, 31, 30, 32]. Развивая прежние исследования по изучению механизма участия хлорофилла в инициируемых све том процессах переноса электрона и протона [65], Красновский показал, что хлорофилл, осажденный в виде комплекса с Цит с, вызывает его окислительно-восстановительные превращения.
Необходимо подчеркнуть, что между подобными фотохими ческими моделями и так называемыми пигмент-белковыми комп лексами, создаваемыми Гиллером, Сапожниковым [45], Толибековьш [131], Серебровской, Лозовой [77, 122], и между нативными или модифицированными пигмент-белковыми комп лексами существуют различия принципиального характера. 1
Чрезвычайное углубление представлений о механизме фото синтеза привело к осознанию сложности функций, выполняемых всеми компонентами хлоропласта как в биохимическом, так и в структурном отношении. Поэтому применение искусственных комплексов целесообразно только для решения четко сформули рованных задач из области фотохимии, некоторых эволюцион ных вопросов и т. д. Однако в настоящее время вряд ли можно серьезно рассматривать вопрос об искусственном фотосинтезе на основе таких пигмент-белковых комплексов.
4. ИЗУЧЕНИЕ ПБЛВ-КОМПЛЕКСОВ, ОТНОСЯЩИХСЯ К ДВУМ ФОТОСИСТЕМАМ
За последние годы с помощью методов препаративной биохи мии достигнуты значительные успехи в воспроизведении реакций фотосинтеза вне целого хлоропласта. К важнейшим достижени ям следует отнести разделение хлоропластов на ПБЛВ-комплек- сы и достаточно подробное сравнительное изучение их биохими ческого состава и фотохимической активности.
Первое сообщение по этому вопросу было опубликовано Боардманом и Андерсон только в 1964 г. [246, 167], но эта об ласть исследований стала развиваться особенно стремительно. Естественно, что необычайно бурное развитие исследований в каком-либо направлении является весьма весомым доказатель ством его важности.
Авторы первых публикаций избрали для дробления тилакоидных мембран детергенты с дальнейшим разделением частиц дифференциальным центрифугированием. Отдельные фракции были получены при строгом контроле среды инкубации хлоро пластов, силы поля гравитации и времени центрифугирования.
Новый толчок исследованиям по разделению фотосистем да ло использование физических методов разрушения мембран —• озвучивания или выделения ПБЛВ-комплексов продавливанием
через калиброванные отверстия при высоком давлении. Преиму щество физических методов состоит в том, что удается, во-пер вых, избежать химического воздействия детергентов как агентов, активно реагирующих с отдельными компонентами комплексов и вытесняющих из них липиды, а во-вторых, получать более чет кие фракции частиц. Рассмотрим эти работы.
Действие детергентов и фракционирование фотохимических систем. Боардман и Андерсон впервые так подобрали условия* состав среды, скорость и время центрифугирования, что отдель ные выделенные фракции были обогащены частицами, представ ляющими ФС-І или ФС-П.
Ниже приведены основные сведения об условиях выделения частиц после получасовой инкубации хлоропластов из шпината в 0,5%-ном дигитонине при температуре 0 С. Отдельные фрак ции охарактеризованы по отношению Хл а/Хл b [247] (табл. 1)1
Т а б л и ц а 1 Выделение частиц из хлоропластов после инкуба
ции с дигитонином |
(по Боардману и Андерсон) |
||
Условия |
Время |
Распре |
|
центрифу |
Хл а/Хл Ь |
||
центрифугирования, g |
гирования, |
деление |
|
|
мин |
Хл. % |
|
Исходные хлоропласты |
_ |
|
2,83 |
1 ООО |
10 |
19,0 |
2,36 |
10 ООО |
30 |
46,2 |
2,27 |
50 ООО |
30 |
12,3 |
4,40 |
144 000 |
60 |
11,7 |
5,34 |
Супернатант |
— |
10,8 |
3,76 |
Соответствующие осадки, ресуспендированные Боардманом и
Андерсон в фосфатном буфере, получили |
название по |
величи |
||||||||||
нам g, |
при которых |
их осаждали. Частицы, которые не удалось |
||||||||||
осадить, центрифугированием |
в течение 1 ч |
при 144 000 g, |
были |
|||||||||
обозначены как супернатант 144 000 g. |
|
|
|
|
||||||||
Для |
лучшего |
разрешения |
пиков |
Хл а и Хл & in vivo авторы |
||||||||
изучали |
спектры |
при |
температуре |
жидкого |
азота [77° К] . На |
|||||||
рис. |
32 |
из работы |
Боардмана с соавт. [249] сравниваются |
|||||||||
спектры |
поглощения |
фракций |
10 000 g и |
144 000 g. |
Фракция |
|||||||
10 000 g обнаружила |
увеличение |
поглощения |
при 650 и 470 нм, |
|||||||||
что |
доказывает |
более |
высокое |
содержание |
Хл Ь. Плечо |
при |
||||||
490 |
нм, очевидно, |
обусловлено |
каротиноидами. |
Фрдкция |
144 000 g обнаруживает увеличение поглощения при 705—710 нм, что свидетельствует о высоком содержании дальней красной фор мы Хл а. Из разностного спектра фракции 144 000 g против 10 000 g, определенного при комнатной температуре, следует, что фракция 10 000 g содержит относительно больше формы Хл a670i
Для фракции 144 000 g, полученной после процедур фрагмен тации с дигитонином, отношение Хл/П700 было равно 205, а для
целых хлоропластов — 440. Фракция 10 000 |
g |
содержала |
1 моль |
|||||||||||||
П700 только на 690 моль Хл [168, 244]. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
Метод |
разделения, |
предложенный |
Боардманом |
и Андерсон, |
|||||||||||
вызвал |
появление большого числа исследований с использовани |
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
ем |
как |
дигитонниа, |
|
так |
и |
|||||
D |
А |
|
|
|
других |
детергентов. Охки |
и |
|||||||||
0.8 |
|
|
|
Такамия |
[781,] |
|
использова |
|||||||||
|
// ' 1 |
|
|
|
ли |
|
фрагментацию |
с |
помо |
|||||||
0,6 Г |
\ А |
|
|
|
щью |
дигитонина |
для |
более |
||||||||
|
|
\ |
\ |
|
|
подробной |
характеристики |
|||||||||
0А |
|
1 г |
\ |
|
|
фракций, |
выделяемых |
при |
||||||||
|
|
|
\ X |
|
|
центрифугировании |
в гради |
|||||||||
|
|
А\\ \ |
|
|
||||||||||||
Q2 |
|
|
|
енте плотности сахарозы |
при |
|||||||||||
|
|
|
V |
|
|
51 000 |
g в течение |
50 |
мин. |
|||||||
0 |
|
|
|
|
|
Эти |
исследователи примени |
|||||||||
W |
|
500 |
600 |
700 А,нн |
ли |
|
сравнительно |
высокую |
||||||||
Рис. 32. Спектры поглощения частиц из |
концентрацию |
|
дигитонина |
|||||||||||||
фракций после инкубации с дигитонином |
(20 : 1, по |
отношению |
к хло |
|||||||||||||
при |
выделении путем |
дифференциально |
рофиллу) . Из трех выделен |
|||||||||||||
го |
центрифугирования. |
|
ных |
фракций |
одна |
|
относи |
|||||||||
из |
осадка 144 000 g (по |
Боардману с соавт. |
лась |
к ФС-1 |
и |
содержала |
||||||||||
/ — фракция |
из осадка |
10 000 |
8. 2 — фракция |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
(2491). |
|
|
|
|
90% |
всего П700, |
найденного |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
в двух |
других. Авторы |
под |
твердили распределение хлорофилла поровну между фотосисте мами, однако не выявили существенных различий между двумя фракциями, относящимися к ФС-П, но выделенными раздельно. Фотохимическая активность хлоропластов из фракций после об
работки дигитонином |
показана |
в табл. 2 |
[166]. |
|
|
|
|
|
|
|
Т а б л и ц а |
2 |
|
Скорость |
восстановления окислителей, мкмоль/мг |
Хл-н |
|
|||
Фракция |
Феррици- |
ДХФИФ |
НАДФ+ |
НАДФ+ |
+ |
|
аиид |
+ АК |
+ |
||||
|
|
|
|
|
+ Д Х Ф И Ф |
|
Хлоропласты |
255 |
152 |
96 |
|
|
|
Хлоропласты после |
|
|
|
|
||
инкубации с дигито |
|
|
|
|
||
нином |
|
138 |
81 |
33 |
18 |
|
1 000 |
g |
209 |
139 |
24 |
14 |
|
10 000 |
g |
160 |
61 |
17 |
17 |
|
50 000 |
g |
43 |
0 |
0 |
70 |
|
144 000 |
g |
0 |
0 |
0 |
123 |
|
Опернатант |
|
|
|
|
|
|
"144 000 |
g |
0 |
0 |
0 |
103 |
|
Обработка хлоропластов дигитонином приводит, вообще го воря, к резкому снижению уровня реакции Хилла. Поэтому ак-
тивность должна сравниваться с активностью целых хлоропла
стов, |
также подвергнутых действию дигитонина. Фракции |
1000 g |
|
и 10 |
ООО g относительно |
активнее с феррицианидом и ТХФИФ, |
|
чем «целые хлоропласты» |
(но с дигитонином), и намного |
актив |
нее мелких частиц. Выделение кислорода находится в стехиомет-
рическом отношении с восстановлением феррицианида. |
Наобо |
||||
рот, |
весьма велика активность восстановления НАДФ+ мел |
||||
кими |
частицами |
в присутствии |
электронодонорной системы |
||
АК + |
ДХФИФ, тогда как «тяжелые» частицы в этом отношении |
||||
проявляют слабую |
активность. |
|
|
||
Активность |
супернатанта 144 000 g на 20—30% ниже |
актив |
|||
ности фракции |
144 |
000 g. |
|
|
|
Действие неионного детергента |
тритона Х-100 также |
приво |
дит к получению ПБЛВ-комплексов, относящихся к двум фото системам [943, 939, 263, 267, 268].
Концентрации тритона Х-100 порядка 0,008% разобщают ре акцию ФФ, а концентрации порядка 0,01—0,02% ингибируют реакцию Хилла, хотя реакции ФС-І при этом происходят [942]. В работах группы Вернона для разделения частиц использовали 0,05, 0,2 и 4%-ную концентрации этого детергента. Высокие концентрации приводили к более глубокому разрушению хлоро пластов.
Метод получения фотохимически активных частиц в работе с тритоном Х-100 сводится к следующему: хлоропласты из шпина та выделяли в 0,35 М NaCl с 0,02 М грыс-буфером. рН 7,8, затем инкубировали в растворе сахарозы (конечная концентрация 0,5 М) с трициновым буфером рН 7,5 и 4%-ным тритоном Х-100
при 0° С. При центрифугировании в |
течение |
20 мин фракция |
||
10 000 g содержала частицы, относящиеся |
к |
ФС-И: отношение |
||
Хл а/Хл b составляло 2, содержание лютеина было |
повышено |
|||
[943]. Ранее в работах группы Вернона эта |
фракция |
называ |
||
лась P-I, затем во избежание путаницы |
ее |
переименовали в |
||
ТСФ-Н (тритон-субхлоропластные фрагменты ФС-П). |
|
|||
Фракцию частиц ФС-І осаждали |
при 144 000 g за |
10 ч цен |
||
трифугирования (фракцию назвали |
PD-10, а |
позднее |
ТСФ-І). |
Эта фракция весьма напоминала фракцию 144 000 g из дигитони на [939]. Отношение Хл а/Хл b составляло 5,7. Частицы в при сутствии А К + Д Х Ф И Ф восстанавливали НАДФ+ при добавле нии Фд, Фп и Пц. Активность исчезала при нагревании до 40° С за 5 мин. Таким образом, с помощью тритона Х-100 удалось, в конечном итоге, получить субхлоропластные частицы, которые, подобно субхлоропластным частицам, полученным с помощью дигитонина в работах группы Боардмана, относятся соответ ственно к ФС-І или ФС-П. Однако, по-видимому, тритон Х-100 ведет себя более агрессивно по отношению к энзиматическим ак тивностям, характерным для обеих фотосистем.
Долгое время при использовании тритона Х-100 вообще не удалось получить фотохимически активные частицы [939].
В табл. 3 сравнивается |
состав частиц, относящихся |
к ФС-П |
и ФС-І, выделенных путем |
обработки дигитонином (по |
Боард- |
ману с соавт. [247]) и тритоном Х-100 (по Вернону с соавт. [939, 940]). Фракции 10 000 g и ТСФ-П относятся к ФС-П при обра ботке соответственно дигитонином и тритоном Х-100, как описа но выше, а фракции 144 000 g и ТСФ-І относятся к ФС-І. В по следнем столбце приведены данные из работы Вернона с соавт. для не обработанных детергентом хлоропластов.
Состав субхлоропластных |
частиц |
|
|
Т а б л и ц а 3 |
||||
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
Фотосистема И |
Фотосистема 1 |
Целые хлоро |
||
|
Компонент |
10 000 g |
|
|
|
|||
|
ТСФ-П |
144 000 g |
ТСФ-І |
пласти (по |
||||
|
|
|
Днгитоннн |
Тритон |
Днгитоннн |
Тритон |
Вернону) |
|
Хл |
а |
|
|
67 |
67 |
85 |
85 |
70 |
Хл |
6 |
|
|
33 |
33 |
15 |
15 |
30 |
П700 |
|
|
0,14 |
0,5 |
0,5 |
1,4 |
0,4 |
|
Хл |
а/Хл |
Ь |
|
2 |
2 |
5,7 |
5,7 |
2,4 |
Р-Каротин |
|
|
7 |
6 |
14 |
16 |
6,3 |
|
Лютеин |
|
|
15 |
16 |
6 |
6 |
9,6 |
|
Неоксантин |
|
5 |
2 |
2 |
1 |
2,5 |
||
Виолаксантнн |
А |
6 |
3 |
5 |
1 |
2,8 |
||
Пластохинон |
2,1 |
1.8 |
3 |
5,5 |
7,2 |
|||
Пластохннон |
В |
0.2 |
0,2 |
1.2 |
4,5 |
4,2 |
||
Пластохинон С -f- D |
0,7 |
0 |
0,6 |
3,3 |
— |
|||
а-Токоферолхинон |
0,8 |
0,3 |
1,8 |
0,5 |
1,9 |
|||
Цитохром |
6в |
|
— |
0 |
— |
(2) |
— |
|
Цитохром |
/ |
|
— |
0 |
— |
(2) |
— |
|
Цитохром |
6559 |
— |
1 |
— |
0 |
— |
||
Моногалактозил -дигли - |
— |
|
— |
25 |
|
|||
церид |
|
|
53 |
115 |
||||
Дигалактозил-диглнце- |
— |
30 |
— |
12 |
60 |
|||
рид |
|
|
|
|||||
Фосфатидил - гл ицерол |
— |
16 |
— |
5 |
21 |
|||
Сульфолипидлецитин |
— |
6 |
— |
2 |
9 |
|||
Белок |
|
|
1,7 |
0,5 |
1,2 |
1,0 |
0,4 |
Все величины выражены в молях на 100 моль Хл a-f-Хл Ь. Брил с сотр. [271] применяли деоксихолат натрия для выделе ния фрагментов из хлоропластов. Наилучшее разделение дости гнуто при концентрации 0,4% в 0,15 М К О при концентрации хлорофилла 100 мкг/мл. Тяжелые фрагменты (10 000 g, 30 мин),
обогащенные Хл 6 |
= 1,9 j , |
обнаруживали низкотемпера |
турные спектры флуоресценции при 683 и 695 нм и были неак тивны в отношении реакции Хилла с ДХФИФ. Во фракции 144 000 g, полученной центрифугированием за 60 мин, отноше ние -ё^ч равно 6,6. Максимум низкотемпературного спектра флуо-
ресценции находился при 735 нм. Деоксихолат, как и додецилсульфат натрия, также не нашел пока применения. Дигитонин и тритон Х-100 использовались до сих пор наиболее широко. По степени повреждающего действия фотохимических функций дигитонин оказывается более мягким, чем тритон Х-100, кото
рый, в свою очередь, обладает |
менее разрушающим эффектом, |
|||
чем додецилсульфат натрия. |
|
|
|
|
Биохимический состав субхлоропластных частиц. Особенно |
||||
сти поглощения |
и флуоресценции. Типичные |
спектры |
флуоре |
|
сценции целых |
хлоропластов |
и частиц, относящихся |
к ФС-П |
|
(10 000 g) и ФС-І (144 000 g), |
измеряемой при комнатной тем |
|||
пературе и температуре кипения жидкого азота |
(77° К), показа |
|||
ны на рис. 33. |
|
|
|
|
Рис. 33. Спектры |
флуоресценции при температуре 293° К (1) и 77° К |
(2) целых |
|||
хлоропластов (а), |
частиц фракций |
10 000 g |
(б) и 144 000 g |
(в) (по |
Боардма- |
ну [249]). |
|
|
|
|
|
Гедерстанд |
и Говинджи |
описали |
особенности |
абсорбции и |
|
флуоресценции |
пигментов при сравнении частиц |
Д-10 и Д-144 |
(10 000 g |
и 144 000 g при фрагментации дигитонином) при ком |
||||
натной и |
низких |
температурах [416]. Плечо |
при 650 нм, обна |
||
руживаемое |
во |
фракции |
Д-10, указывает |
на сравнительное |
|
обогащение |
этой |
фракции |
Хл Ь. Эта фракция |
содержит относи |
|
тельно большие |
количества формы Хл 670. Абсорбционные мак |
симумы для фракций Д-10 и Д-144 находятся соответственно при 677 и 679 нм, тогда как для целых хлоропластов — при 678,5 нм. В супернатанте 144 000 g максимум обнаруживается при 675 нм, что указывает на содержание в нем солюбилизированного диги
тонином хлорофилла. Нагревание фракций |
в течение 2 мин при |
65° С сдвигает максимум поглощения в |
обеих фракциях до |
669—670 нм. Авторы пришли к выводу, что по сравнению с фрак циями частиц Д-10 и Д-50 мелкие частицы содержат больше пространственно ориентированных молекул хлорофилла.
Крамер и Батлер [318] изучили производный спектр погло щения частиц хлоропластов, выделенных после фрагментации с дигитонином. Производный спектр интактных хлоропластов имел
полосы 641 (а), 652 (Ь), 663 (с), 673 (d), 682 (е), 686 |
(f), |
ю* |
147 |
690 |
(g) и 698 нм (h). Для частиц ФС-П |
были характерны поло |
|
сы |
641, 652, 663, 673 |
и 682 нм, а для |
частиц ФС-І — 690 и |
698 |
нм наряду с другими |
полосами. |
|
Для частиц ФС-П характерно наличие двух типов Хл а с мак симумами поглощения при 670 и 676 нм, для частиц ФС-І — один тип Хл а с максимумом при 680 нм.
Один из выводов работы состоял в констатации трудностей разделения частиц без взаимного загрязнения.
Изучение особенностей флуоресценции показало, что при комнатной температуре фракция 144 ООО g флуоресцирует слабо. Выход флуоресценции не усиливается в условиях окисления — восстановления или при добавлении моноурона, или же при вне
сении кофакторов и энзимов, стимулирующих перенос |
электрона |
||
на НАДФ+ |
[249J. Фракция |
10 000 g флуоресцирует |
сильнее. |
Добавление |
феррицианида |
ослабляет флуоресценцию во |
фракции 10 000 g, тогда как гидросульфит или моноурон усилива ют ее.
Эти отношения иллюстрируются следующими сравнительны
ми показателями квантового выхода флуоресценции, |
экв/кв, |
по |
|
фракциям хлоропластов: |
|
|
|
Хлоропласти (контроль) |
0,007 |
|
|
Хлоропласты, в 0,5%-ном |
|
|
|
днгитоннне |
0,011 |
|
|
10 000 g |
0,016 |
|
|
144 000 g |
0,003 |
|
|
Хл а, в этаноле |
0,235 |
|
|
Эти данные соответствуют заключению Дюйсенса и Свирса |
|||
[356], что Хл а в ФС-І флуоресцирует |
слабо, тогда |
как он же |
|
в ФС-П способен к относительно сильной флуоресценции, |
уро |
вень которой зависит, правда, от окислительно-восстановитель ных условий.
.•Спектры флуоресценции целых хлоропластов, охлажденных до 77° К, обнаружили полосы при 683, 693 и 735 нм. Фракция 10 000 g выявила низкотемпературный спектр флуоресценции, который оказался сходным с таковым в неразрушенных хлоро пластах, но с уменьшенной полосой при 735 нм. Его вклад в об щую флуоресценцию составлял 60% по сравнению с 75% в слу
чае хлоропластов. Для спектра фракции |
144 000 g, наоборот, |
характерно преобладание флуоресценции |
при 735 нм, вклад ее |
в общую флуоресценцию по расчету составляет 97%. Фракции,
выделенные |
из озвученных хлоропластов, |
не обнаруживали |
|||
изменений в спектрах при /7° К [249], откуда |
следовало, что на |
||||
блюдаемые |
спектры |
во фракциях 10 |
000 g и 144 000 g не явля |
||
лись артефактами, |
обусловленными |
различными |
размерами |
||
частиц. Было сделано заключение, что флуоресценция |
хлоропла |
||||
стов при 735 нм, охлажденных до 77° К, обусловлена |
главным |
||||
образом ФС-І, а при 683 и 693 нм — ФС-Н |
[247, 244]. К анало- |
гичному выводу пришли Кок и Рураински [634]. При 735 нм, по-видимому, флуоресцирует форма Хл а с максимумом погло щения при 705 нм [245].
Боардман с соавт. [249] измеряли спектры возбуждения флуоресценции фракций 10 000 g и 144 000 g при 20° С и 77° .К- Кванты, поглощенные при 470 нм, более эффективны по отно шению к квантам, поглощенным при 436 нм, в возбуждении флу оресценции с фракцией 10 000 g, чем с фракцией 144 000 g. Этот результат позволяет предположить наличие более высокого уров ня содержания Хл Ь во фракции 10 000 g. Но более важное за ключение состоит в том, что Хл Ь и каротиноиды сенсибилизиру
ют флуоресценцию Хл а в обеих фотосистемах; |
иначе говоря, |
||||
Хл |
Ь и каротиноиды |
проявляют активность в «собирании |
уро |
||
жая |
квантов» |
света |
для первичных фотохимических процессов |
||
ФС-І и ФС-П |
[244], |
будучи активнее в частицах |
ФС-П |
[245]. |
Восстановление реагентов Хилла. Если с целыми хлоропла стами скорость восстановления НАДФ+ в присутствии экзоген ного Фд достаточно высока и в этом случае добавок Фп не тре буется [329], то для реконструкции ЭТЦ с частицами 144 000 g необходимо вносить как Фд, так и Фп [246, 166].
Фотохимическая активность фракции 144 000 g заметно ва рьирует также при обработке различными образцами дигитони на [245]. Элстнер и Требст [363, 919] показали, что мелкие частицы, полученные после обработки дигитонином, увели чивают фоторедукцию НАДФ+ при добавлении Пц или Цит / из эвглены.
Согласно Вернону с соавт. [938], в присутствии Фд, Фп и Пц скорость фоторедукции НАДФ+ с фракцией частиц 144 000 g до
стигает |
1400 мкмоль/мг |
Хл • ч при |
рН 6,0. |
Стимуляция |
фото |
редукции НАДФ+ мелкими частицами из |
хлоропластов |
го |
|||
роха в |
присутствии Пц |
показана |
также Акуловой и Мухи |
||
ным [2]. |
|
|
|
|
Арнон с соавт. [185] исследовали активность ФФ в частицах после фрагментации с дигитонином. Скорость НФФ с частицами 10 000 g была втрое меньше, чем с целыми хлоропластами, а с
частицами |
144 000 g равнялась нулю. |
Отношение |
~ Р / 2 е ~ для |
|||||||
фракции 10 000 g составляло |
0,6 |
с |
феррицианидом |
и |
0,8 |
с |
||||
НАДФ+. ЦФФ составляло 13% по отношению к целым |
хлоро |
|||||||||
пластам |
в |
присутствии Фд, |
1 8 % — к |
менадиону |
и |
2 4 % — к |
||||
ФМС. |
В |
противоположность |
частицам |
10 000 |
g, |
частицы |
||||
144 000 |
g были неактивны с менадионом или Фд, а с ФМС |
ак |
||||||||
тивность составляла только 15%- Арнон и соавт. [185] |
рассмат |
|||||||||
ривали |
обнаруженную частицами |
10 000 g |
активность |
в |
восста |
новлении НАДФ+ как доказательство возможности восстановле ния НАДФ+ посредством одной ФС-П и указывали на сходство этих частиц по химическому составу с частицами, выделенными Боардманом с соавт. [246, 166]. В то же время Арнон с соавт, подчеркивали [185], что способность тяжелых частиц к фото-