книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

мєтилвнологена. При подавлении транспорта электронов по типу

товый расход для фоторедукции НАДФ+ в ходе «нормальной» реакции Хилла в различных реконструированных системах с квантовым расходом в системе, в которую вносился диурон и применялась пара ДХФИФ — АК в качестве донора электрона. Хотя абсолютные значения квантового расхода несколько разли­ чались при измерениях в разных лабораториях, общая тенденция оказалась одинаковой. При длинах волн от 550 до 690 нм кван­ товый расход для восстановления НАДФ+ в «нормальной» ре­ акции Хйлла обычно постоянен: около 2—4 квантов на хими­

тронодонорной пары АК — ДХФИФ. Если единственным донором

Привлечение экзогенного животного Цит с является одним из перспективных направлений исследования процессов переноса электрона в хлоропластах.

Резкие и значительные изменения экстинкции в области а- полосы поглощения Цит с (при 550 нм) определяют легкость проведения наблюдений за окислительно-восстановительными из­ менениями этого вещества при использовании простого спектро­ фотометра. На рис. 21 показано, что освещение смеси хлороплас­ тов с Цит с вызывает увеличение экстинкции при 550 нм, обус­ ловленное восстановлением Цит с. После выключения света происходит уменьшение поглощения, обусловленное обратным окислением Цит с в смеси со свежими хлоропластами. Такие изме­ нения впервые были продемонстрированы Мелером [716] и под­ тверждены Ягендорфом [541], который наблюдал многократныециклы фоторедукции Цит с и его последующего окисления в темноте после выключения света. Темновое окисление восстанов- • ленного на свету Цит с обусловлено, по мнению Ягендорфа, за­ грязнением хлоропластов митохондриями и вмешательством той цитохромоксидазы, которая в них содержится. Многократно отмы-

стви» достаточного количества хлоропластов (содержание Хл порядка 0,3 мг на сосудик). Так как молекулярный вес феррицнанида калия составляет 329, в сосудике в объеме жидкой фазы около 3 мл должно содержаться приблизительно 1 мг феррицианида. Учитывая, что молекулярный вес Цит с в 40 раз больше молекулярного веса феррицианида, реакцию Хилла с Цит с при­ ходится проводить в чрезвычайно концентрированном растворе этого белка, что вносит ряд трудностей. Одна из них состоит в возможном взаимодействии такого избытка Цит с с хлоропластами, а другая — в проявлении чисто фотохимических свойств Цит с независимо от отношения к реакции Хилла.

В наших опытах с хлоропластами шпината достоверное вы­ деление кислорода при наличии одного Цит с в качестве окис­ лителя обнаружить манометрическим методом не удалось *. Однако удалось показать, что выделение Ог усиливается при до­ бавлении Цит с к феррицианиду. Это можно видеть из следую­ щих данных (результаты выражены в мкл 02/мг Хл-ч):

Цит с выступал как катализатор в реакции Хилла с феррицианидом; его уменьшение в пять раз в пробе заметно не влия­ ло на степень усиления выделения Ог при восстановлении фер­ рицианида.

«Эндогенный» и «экзогенный» пути фоторедукции Цит с.

Кейстер и Сан-Пьетро [607] и Эйнор с Решетниковой [155] показали, что уровень фоторедукции Цит с хлоропластами в мо­ дельной системе усиливается при внесении фракции белков ФПНР (ФПНР — неочищенная смесь водорастворимых белков, содержащая Фд, Фп, Пц и некоторые другие).

В условиях многократного промывания хлоропластов центри­ фугированием происходит вымывание Фд. Кейстер и Сан-Пьетро считают, что восстановление добавляемого Цит с к хлоропластам при действии света происходит двумя различными путями — эндогенным и экзогенным; последний зависит от внесения ФПНР. Увеличение ионной силы в растворе с хлоропластами ингибирует эндогенный путь фоторедукции Цит с, но стимулирует фоторе­ дукцию в присутствии белковой фракции [607].

Эйнор и Решетникова обнаружили, что оптимумы рН для эндогенного пути и пути фоторедукции Цит с, стимулируемого

* В этих опытах в объеме 3,0 мл манометрических сосудиков содержалось 0,2—0,4 мг Хл хлоропластов, 50 мкмоль 7рис-НС1-буфера рН 7,8, 10 мкмоль феррицианида, 2 мг Цит с, по 10 мкмоль MgCl 2 и К2НРО4; температура 25° С. Освещение 10 000 лк на уровне сосудика создавалось лампой ДРЛ-500 мано­ метрического прибора [129].

(триметилбензохинон) способны усиливать скорость фоторедук-- ции Цит с, причем сделан вывод, что хлоропласты не могли непо­ средственно реагировать с Цит с.

Ниман и Веннесланд [763] отмечали медленное падение спо­ собности к фоторедукции Цит с при хранении хлоропластов в те­ чение нескольких дней при 0° С и значительно более быструю потерю активности темновой оксидазы. Это было подтверждено в нашей работе [147, 155]. Позднее хранение хлоропластов без потери активности фоторедукции мы стали проводить по методу Бекиной и Красновского [13], как описано выше, в 50%-ном гли­ церине.

10-минутное термостатирование при 40° С снижает уровень фоторедукции примерно в 9 раз, а при 50° С — в 20 раз [147, 155].

По данным Эйнора и Львовской, самые разнообразные веще­ ства оказывают защитное действие на сохранение хлоропластами способности к фоторедукции Цит с при прогревании. На рис. 23 показано влияние АДФ, АТФ, альбумина, глицерина и этанола при прогревании с хлоропластами в течение 1 ч при 40° С на уровень последующей фоторедукции Цит с. Контролем служили аналогичные смеси, хранившиеся при +4° С (незачерненные час­ ти столбиков).

В опытах по изучению влияния НАДФ+ на уровень фоторе­ дукцій! Цит с по изменениям оптической плотности при 550 нм удалось установить следующее. Внесение НАДФ, особенно вмес­ те с фракцией белка, обогащенной Фд, увеличивает уровень фо­ торедукции Цит с. Вытеснение кислорода продуваемым через кю­ вету азотом приводит к заметному увеличению фоторедукции Цит с в кювете, содержащей НАДФ+ вместе с белковой фрак­ цией, по сравнению с кюветами без белковой фракции и НАДФ+. Спустя некоторое время характер фоторедукцни в этом варианте по сравнению с вариантами без белковой фракции изменялся в обратном направлении, причем характерно, что в варианте Цит с + НАДФ+ без ФПНР амплитуда изменений окислительновосстановительного состояния Цит с в циклах свет — темнота оказывается наивысшей. Это доказывает более высокую конку­ рентную способность Цит с по сравнению с НАДФ+, хотя и не является прямым доказательством того, что ЭТЦ фоторедукции Цит с включает НАДФ-Н в роли интермедиата.

Действие ингибиторов исследовалось в нескольких работах [763, 147]. По-видимому, цианид, азид натрия, моноиодуксусная кислота, 2,4-динитрофенол, антнмицин А, парахлормеркурибензоат в концентрациях Ю - 5 — Ю - 3 М не влияют на ход фоторе­ дукции Цит с по эндогенному пути.

С другой стороны, Кейстер и Сан-Пьетро [607] показали, что фоторедукция Цит с в присутствии ФПНР ннгнбируется парахлормеркурибензоатом на 20—60% при повышении его концен­ трации от 2-Ю- "6 до 1 - Ю - 5 М, но при коротких экспозициях это ингибирование в значительной степени снимается цистеином. Действие парахлормеркурибензоата и некоторых других ядов вы­ явило различия в характере фоторедукции Цит с по эндогенному и экзогенному пути.

Нами было показано, что 1,5Т0~3 М салицилальдоксим даже слегка стимулировал фоторедукцию Цит с по эндогенному пути. Диурон в концентрации порядка 1-Ю- 6 М практически пол­ ностью ингибировал фоторедукцию Цит с как по эндоген­ ному пути, так и в присутствии Фд. Последнее доказывает необ­ ходимость ФС-П для фоторедукции Цит с в обоих случаях.

раций гидроксиламина ингибирование достигало 70—90% в раз­ ных опытах, то при концентрации Ю - 4 М было несколько мень­ шим. Следовательно, гидроксиламин частично заменяет воду в качестве донора электрона в реконструированной цепи фоторе­ дукции Цит с.

Ниже приводятся краткие результаты работ по изучению вли­ яния различных классов веществ на уровень фоторедукции Цит с хлоропластами.

При эндогенном пути фоторедукции (без добавления извне препаратов ФПНР или чистого Фд) стимулировал исходный уро-

тогда как один Ф„ несколько ингибировал исходный уровень фо­ торедукции. Значительно (на 100—200%) усиливали фоторедук-

а-нафтолфлавон, рибофлавин, тиамингидрохлорид, тиаминпирофосфат, окисленный глутатион, ФМС в низкой концентрации, ЭДТА не влияют на соотношение окисленной и восстановленной форм Цит с в растворах солей при рН 7—8 в темноте или при умеренном освещении (без хлоропластов).

Кейстер и Сан-Пьетро убедительно доказали, что ФПНР в присутствии фосфатакцептирующей системы резко увеличивает уровень фоторедукции Цит с, и показали большое сходство в по­ ведении Цит с и НАДФ; однако были обнаружены факты, свиде­ тельствующие против признания единого пути фоторедукции НАДФ+ и Цит с:

а) фракция белков ФПНР вымывается при последовательных центрифугированиях хлоропластов, но отношение скорости эндо­ генного восстановления к скорости, стимулируемой ФПНР, не меняется при промывке;

б) увеличение концентрации NaCl ингибирует эндогенный путь, но стимулирует путь через ФПНР;

в) если для фоторедукции НАДФ+ требуется Фп (Фд-НАДФ+- трансгидрогеназа), то для фоторедукции Цит с этого фермента не требовалось, что доказывалось опытами с применением анти­ сывороток.

Недавно нами было установлено, что чистый Фд стимулирует фоторедукцию Цит с хлоропластами. Противоречия с прежними результатами нашей совместной работы с Решетниковой [155], в которой было показано уменьшение уровня фоторедукции в приг сутствии неочищенной фракции ФПНР, здесь нет. Видимо, это та же фракция, с которой работали Кейстер и Сан-Пьетро, но кроме Фд в ней содержатся неизвестные факторы, которые обусловли­ вают нейтрализацию действия Цит с как ингибитора (разобщи­ теля) ФФ.

При испытаниях влияния органических растворителей на фоторедукцию Цит с хлоропластами оказалось, что ацетон пол­ ностью ингибирует фоторедукцию, если его концентрация в реак­ ционной смеси превышает несколько процентов. Этанол в кон­ центрации до 1,3-Ю- 2 М не оказывал эффекта, но уже в концен­ трации 1 М ингибировал фоторедукцию на 40%. Особый интерес представляет, глицерин как отличный, стабилизирующий агент. Ранее мы показали, что глицерин в 10—20%-ной концентрации усиливает уровень фоторедукции Цит с. На основании большого числа опытов мы пришли к заключению, что расцениваемые на­ ми ранее [147] эффекты глицерина как усиление фоторедукции надо рассматривать скорее как проявление стабилизирующего действия глицерина на хлоропласты. Поэтому в реакционные смеси при изучении фоторедукции Цит с мы теперь обычно вно­ сим глицерин в 10%-ной концентрации.

При более высоких концентрациях глицерина фоторедукция Цит с замедляется, что объясняется резким повышением вяз­ кости растворов и снижением диэлектрической постоянной. Все

в смеси фракции белков ФПНР. Гликолат не изменял, а при наличии ФПНР снижал эндогенный уровень фоторедукции Цит с; действие глиоксалата и сукцината было противоположно действию гликолата. Лактат и ацетат не проявляли заметного дей­ ствия на уровень фоторедукции Цит с; фракция ФПНР повы­ шала исходный уровень примерно так же, как в их отсутствие. Эти опыты проводили в среде фосфатного буфера при рН 7,4.

Ранее Кейстер и Сан-Пьетро убедительно доказали, что путь фоторедукции Цит с через ФПНР сопровождается ФФ с величи­ ной отношения ~ Р / 2 е ~ , возраставшей до 1 при увеличении кон­ центрации ФПНР. Напротив, для эндогенного пути величина от­ ношения ~ Р / 2 е - составляла около 0,1 и даже меньше.

Эйнор и Луцишина [153] изучили влияние Цит с на ФФ, ка­ тализируемое ФМН. Независимо от того, проводились ли опыты на воздухе или в анаэробных условиях, в присутствии или в от-

сутствие азида натрия, был ли Цит с в окисленном или восста­ новленном состоянии,— во всех случаях Цит с ингибировал об­ разование АТФ. Позднее аналогичный результат мы получили с ФМС в качестве кофактора ФФ.

Приведенные выше данные совершенно четко доказывают, что фоторедукция Цит с осуществляется двумя путями — экзо­ генным и эндогенным. Для экзогенного пути необходим Фд, и этот путь является фосфорилирующим:

а) для НАДФ Н 2 0 -у ФС-И -у ФС-І -у Фд -у Фп -> НАДФ+;

б) для Цит с Н 2 0 -у ФС-И -у ФС-І -> Фд -> Цит с,

W

где W — неизвестный фактор, нейтрализующий разобщающий эффект; Цит с. Для эндогенного пути фоторедукции Цит с

ФМС Н 2 0 ФС-П ~у Ф С - І І - - Цит с

Фд не требуется, но уровень фоторедукции резко усиливается в присутствии ФМС.

Рассмотрим вопрос о необходимости для фоторедукции Цит с кооперированного действия обеих фотосистем. Обнаруженное на­ ми ингибирование диуроном, симазином и атразином фоторедук­ ции Цит с при наличии и в отсутствие Фд и при различных ве­ личинах рН доказывает необходимость для фоторедукции Цит с ФС-П в обоих случаях.

Доказательством необходимости функционирования ФС-І для осуществления фоторедукции по экзогенному пути служит само

Х-100 на фоторедукцию Цит с и НАДФ+- При низкой концентра­ ции тритона Х-100 (0,008%) в инкубационной среде с хлоропла­ стами наблюдалось усиление фоторедукции этих окислителей в реакции Хилла, причем происходило разобщение ФФ. При кон­ центрации тритона Х-100 выше 0,02% фоторедукция Цит с про­ исходит, по мнению Вернона и Шоу, с участием одной ФС-І, но опосредовалась реакцией с восстанавливаемым на свету триметилпарабензохиноном.

• В наших опытах резкая стимуляция фоторедукции Цит с наблюдалась при внесении ФМС — катализатора ЦФФ, причем ФМС действовал каталитически и при рН, неблагоприятном для экзогенного пути фоторедукцйй. Однако Шварц [855] показал,