книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

время ассимиляции углекислоты; если оборот НАДФ снижается, то имеет место главным образом ЦФФ и преимущественно проис­ ходит синтез белка, для которого необходим только АТФ.

Фд косвенно регулирует соотношение синтеза углеводов и глицерофосфата, а также регулирует синтез углеводов, активи­ руя фруктозо-1,6-фосфатазу, играющую ключевую роль в син­ тезе глюкозы.

Флавопротеин. Фп находится в составе фракции белков ФПНР. Определенную ясность в понимание взаимодействий ме­ жду компонентами этой фракции внесли работы Тагава и Арнона [894], Кейстера с соавт. [608] и Форти [389—394]. В част­ ности, было показано, что при замене фракции белков ФПНР ферредоксином для восстановления НАДФ+ необходимы также белки флавопротеиновой природы, так что термин ФПНР не­ точный.

Итак, восстановление НАДФ+ за счет Фд катализирует Фп. Фп листьев шпината, впервые изолированный Шин, Тагава и Арноном [868], обнаруживает типичный для Фп спектр погло­ щения с максимумами при 275, 385, 456 нм и минимумами при 321 и 410 нм в окисленном состоянии.

В ходе окислительно-восстановительных переходов, в кото­ рых участвует флавиновая группа [867], происходит восстанов­ ление НАДФ:

Замечательным свойством этого Фп является то, что кристал­ лически чистый препарат фермента помимо активности Фд- НАДФ-редуктазы, обнаруживает активность НАДФ • Нг-НАД- трансгидрогеназы [609]:

Как оказалось, этот же фермент был еще в 1956 г. описан Авроном и Ягендорфом [202] как НАДФ-Н-диафораза хлоро­ пластов. Фп осуществляет перенос водорода с НАДФ-Н на целый ряд акцепторов, а в присутствии акцепторов типа ФМН, ФАД, Фд или витамина К ведет себя подобно НАДФ-Н-цитохром-с- редуктазе [868].

Такая удивительная неспецифичность одного и того же фер­ мента делает решение вопроса о его б и о л о г и ч е с к о й р о л и особенно важным.

Кейстер с соавт. [608] показали, что внесение антисыворотки трансгидрогеназы в реакционную смесь к освещенным хлоро­ пластам ингибирует фоторедукцию как НАДФ+, так и НАД+. Это открытие как будто доказывает биологическую значимость редуктазной и трансгидрогеназной функции. Однако Шин и Арнон [866] считают, что трансгидрогеназное действие Фп в фи­ зиологическом отношении не имеет существенного значения для хлоропластов как на свету, так и в темноте, и рассматривают его [867] в качестве вторичной функции Фп. Было показано, что механизм восстановления НАД+ (прямое восстановление за счет

[384, 386, 393, 394], что, на первый взгляд, кажется удивитель­ ным — один и тот же Фп действует, с одной стороны, между Фп и НАДФ+, а с другой — между НАДФ • Н и Цит /, поскольку пе­ ренос электронов осуществляется в такой последовательности:

Фд -> Фп НАДФ -> Цит f.

Учитывая кинетические константы, а также тот факт, что в реакциях с иными, чем Цит / из шпината, акцепторами Фп пре­ терпевает изменения [386, 392, 393], в 1968 г. Форти пришел к за­ ключению, что механизм реакции Фп из хлоропластов шпината с Цит f из высших растений абсолютно специфичен и отличен от механизма реакции с Цит f из эвглены.

Фп в физиологических условиях не реагирует с Пц, следова­ тельно, можно допустить, что именно Цит / участвует в механиз­ ме ФФ.

По Форти [392], Пц и Фп образуют неактивный комплекс, а Пц скорее связан с переносом электрона, характерным для НФФ, что в определенной мере подтверждает схему Кнаффа и Арнона [618-620].

Форти развивает идею о существовании in vivo естественно­ го комплекса Фп с НАДФ+, причем этот пиридиннуклеотид за­ щищает Фп от инактивации и подавляет все активности, кроме активности редуктазы Цит /. Естественно поэтому допустить, что Фп обладает особой физиологической активностью цитохром- f-редуктазы.

В интактных хлоропластах пирофосфат стимулирует фотосин­ тез [554], однако ингибирует восстановление НАДФ+, как и другие зависимые от Фд реакции, по-видимому, препятствуя

Ньюман и Нелсон [760] установили, что некоторые опосреду­ емые Фп реакции, включающие фоторедукцию фосфопиридиннуклеотидов, ингибируются Фд. При внесении определенных кон­ центраций Фд НАД+ может быть восстановлен с большой ско­ ростью. Фд образует комплекс с Фп, и этот комплекс участвует в фоторедукции пиридиннуклеотида. В роли регуляторов высту­ пают неорганические соли (ионы). Авторы полагают, что обра­ зование такого рода комплексов должно происходить и in vivo. Изучение кинетики ингибирования трансгидрогеназных функций Фп показывает, что он обладает двумя пунктами связывания: в одном из них НАДФ • Н отдает Н+; в другом — НАД+ его вос­ принимает, а Фд ингибирует связывание обоих субстратов.

Считается общепризнанным, что перенос электрона от восста­ новленной части ФС-І «вниз» по градиенту химического потен­ циала через Фп и Цит f должен быть сопряжен с образованием АТФ и что реакция эта имеет важное физиологическое значение [937, 363, 505]. Это путь циклического транспорта электронов, инициируемый ДК-светом. Следует подчеркнуть, что как факти­ ческий путь транспорта электронов in vivo, так и механизм фос­ форилирования при этом нам неизвестны.

Многие участники транспорта электронов (цитохромы, П700, Пц) присутствуют в отношении 1 моль : 400 моль Хл, т. е. на одну ФЕ. Некоторые переносчики, например Пх, присутствуют в более высоких отношениях. Пх, по-видимому, способны при вос­ становлении создавать «пулы электронов».

Самой медленной реакцией, ограничивающей скорость всего

Ч а с т ь ПІ

АНАЛИЗ И РЕКОНСТРУИРОВАНИЕ ЭЛЕКТРОНОТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ

Исследования частных реакций фотосинтеза на целом орга­ низме, например на клетках фототрофных штаммов хлореллы, метаболизм которых подчинен фотосинтезу, или на целых лис­ тьях высших растений встречают слишком большие трудности. Уровень хлоропласта также оказывается чересчур сложным, так как реакции и на этом уровне еще чрезвычайно многообразны

изапутанны.

В1938 г. Роберту Хиллу удалось доказать сохранение в го­ могенатах из листьев реакций, относящихся к переносу электро­ нов. При внесении некоторых веществ (искусственных акцепто­ ров электронов) происходило фотоокисление молекул воды с выделением свободного кислорода. Реакции восстановления окислителей и разложения воды осуществлялись за счет погло­ щенной энергии света [487, 490, 493]. Применение чисто искус­ ственных окислителей (например, комплексных солей железа)

В последующие годы изучение реакции, открытой Хиллом (ре­ акции Хилла), получило широкое развитие. Было испытано мно­ жество веществ в качестве реагентов этой реакции, что сыграло определенную роль в становлении современных схем ЭТЦ. Мы рассмотрим участие некоторых веществ в таких реконструирован­ ных цепях переноса электрона и, чтобы конкретизировать неко­ торые подходы, более подробно остановимся на использовании модельных систем с участием экзогенного животного Цит с. По­ следний, как и другие так называемые окислители реакции Хил­ ла, упрощает естественную ЭТЦ, «закорачивая» ее. Наблюдения над окислительно-восстановительными превращениями Цит с по­ зволили сделать определенные заключения о путях его внедрения в ЭТЦ.

Цит с в реконструированных моделях с хлоропластами в одних случаях является акцептором, а в других — донором электрона. Цит с не проявляет ярко выраженных свойств анти­ метаболита в реакции с хлоропластами, подобно ряду других окислителей, например феррицианиду или /г-бензохинону. Отчас­ ти с этим свойством Цит с связано открытие новой группы ве­ ществ — «цитохромвосстанавливающего фактора» (ЦВФ). При этом окисление Цит с служит мерой активности ЦВФ — гипоте­ тического вещества, отождествляемого с X в схемах ЭТЦ.

Наконец, недавно было открыто, что Цит с — необходимый компонент простой модельной системы, в которой синтезируется АТФ при окислении восстановленного глутатиона. Все сказан­ ное выше, как нам кажется, делает обоснованным подробный разбор модельных систем с участием Цит с.

Хотя на функциональных структурах меньших, чем хлоро­ пласт, не удается воспроизвести всю сложную цепь реакций при фотосинтезе, с их помощью легче выяснить роль отдельных ком­ понентов. Необходимо отметить, что разделение хлоропласта на субъединицы следует проводить корректно, используя естествен­ ные поверхности раздела, что сохраняет возможность проявления хотя бы некоторых черт, характерных для работы биоэнергети­ ческого аппарата в целом хлоропласте. На митохондриях из живой ткани разработан такой метод фрагментации, который в перспективе позволяет добиться воссоединения фрагментов с вос­ становлением ЭТЦ [48]. Подобраны и условия дробления хлоро­ пластов на фрагменты, различные по величине, биохимическому составу и выполняемым функциям.

Одним из главных направлений в исследовании фотосинтеза является изучение фотохимических и ферментативных свойств таких пигмент-белковых комплексов, выделенных из хлоропла­ стов, причем в последние годы достигнуты заметные успехи в воспроизведении отдельных функций фотосинтеза вне целых хло­ ропластов. Поэтому в следующих разделах обсуждаются резуль­ таты изучения энергетики фотосинтеза с использованием более простых моделей, чем целый хлоропласт.

1. НЕФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ДОНОРЫ И АКЦЕПТОРЫ ЭЛЕКТРОНА В РЕАКЦИИ Х И Л Л А

Из применяемых акцепторов электрона в реакции Хилла наи­ более часто используют калий железосинеродистый. В качестве окислителя он был впервые применен до 1940 г. [494]. Благодаря «удачной» величине редокс-потенциала, сильным изменениям в спектре поглощения (с пиком 420 нм при восстановлении) и от­ сутствию резко выраженной токсичности в кратковременном экс­ перименте феррицианид широко используется до сих пор [53, 140].

Восстановление феррицианида хлоропластами на свету по уравнению

12К+ + 4Fe (CN)»- + 2 Н 2 0 -> 12К+ + 4Fe (CN)4 - + 4 Н + + О а

сопровождается выделением кислорода и образованием прото­ нов, ввиду чего для наблюдения за ходом этой реакции, помимо методов, основанных на измерении изменений содержания кисло­ рода в среде (манометрического метода с использованием аппа­ рата Варбурга [158] или полярографического, точнее, амперо-

метрического [880], или спектральных методов — по измерению уменьшения экстинкции при 420 нм), применяют также потенциометрические измерения изменений рН [140].

В лаборатории Арнона было показано, что описанная Хиллом реакция отражает транспорт электрона в процессе разобщенно­ го НФФ [6]. К I960 г. было доказано, что восстановление фер­ рицианида и образование АТФ при ФФ находятся в стехиометрических отношениях и, кроме того, что при ограниченном ко­ личестве феррицианида, но избытке АДФ и Фн, ФФ происходит только до тех пор, пока протекает восстановление феррицианида. С прекращением фоторедукции феррицианида ФФ останавли­ вается. Этим доказывается, что феррицианид является именно окислителем, но не кофактором (катализатором) [158]. Как по­ казали Ягендорф и Брюер [262], феррицианид обладает опре­ деленными токсическими свойствами, и поэтому необходимо из­

блюдалась также фоторедукция ФМН и ФАД. С некоторыми из. окислителей дело обстоит сложно: например, восстановление нит­ ритов осуществляется через ФМН или ФАД и Фд [915].

Использование этих реагентов позволяет выделять из всей ЭТЦ отдельные участки, тем самым реконструируя ее.

Надо подчеркнуть, что до сих пор появляются работы, авторы которых весьма безоговорочно судят об активности в отдельнос­ ти ФС-П или ФС-І на основании применения того или иного окислителя, что в ряде случаев ошибочно.

Рассмотрим вопрос о том, какие вещества и в каких случаях служат акцепторами электронов для ФС-П или ФС-І, какие ве­ щества и при каких условиях могут выступать донорами для этих фотосистем. Вероятно, легче доказать, что те или иные веществавосстанавливаются скорее посредством ФС-І, чем с участием, только ФС-П.

Определенным указанием на то, что данный окислитель Хил­ ла взаимодействует непосредственно с ФС-І, служит величина его редокс-потенциала. ФС-П не может восстанавливать окисли­ тели, Е'о которых ниже ~ О в. Вместе с тем использование неко­ торых виологеновых красителей представляет интерес для оп­ ределения величины восстановительной силы, которую создают хлоропласта. Цвейг и Аврон [1032], исследуя возможности вос­ становления хлоропластами таких красителей, для эндогенного фактора X — гипотетического восстановителя ФС-І — определили, значение Е'о в пределах от —0,49 до —0,53 в при нейтральном

рН. Они показали восстановление триквейта — 1,1'-триметилен- 2,2'-дипиридилдибромида — вещества, у которого Е'о = —0,65 в.

Блэк [239] также изучал восстановление диквейта, обратное окисление которого при наличии кислорода протекает по ме­ ханизму реакции Мелера, так как образуется перекись водо­ рода. *

В этих экспериментах наблюдалось и образование АТФ. Позднее Блэком было показано [240], что триквейт служит ко­ фактором ФФ, скорость которого при аэробных условиях сравни­ ма со скоростью фоторедукции НАДФ+. Кок и Рураински [632, 634] пришли к заключению, что, несмотря на различия в Е'0 виологеновых красителей (—0,308 и —0,740 в), их восстановле­ ние протекает с одинаковой скоростью и одинаковым квантовым расходом.

Значительно сложнее решить вопрос о специфическом акцеп­ торе ФС-П, так как требуемый редокс-потенциал позволяет ему быть восстановленным за счет как ФС-И, так и ФС-І. Необхо­ димы четкие доказательства того, что в восстановлении такого акцептора ФС-І участия не принимает.

Рассмотрим с этих позиций феррицианид и ДХФИФ. Благо­ даря выделению ПБЛВ-комплексов из ламеллярных мембран, относящихся к ФС-І и ФС-П, убедительно доказано [450, 520, 199], что ФС-П восстанавливает феррицианид, но не ДХФИФ, и, наоборот, ФС-І восстанавливает ДХФИФ. Однако считать инди­ катором на «работу» ФС-П феррицианид, а ФС-І — ДХФИФ не вполне правомерно. Для ДХФИФ и феррицианида, по-видимо­ му, характерно наличие по меньшей мере двух мест фоторе­ дукции.

В 1964 г. было показано [236, 520], что восстановление ДХФИФ соответствует спектру действия ФС-І. Позднее Кок с соавт. [632] и Ке [600] значительно уточнили эти данные. Ока­ залось, что восстановление ДХФИФ имеет две фазы — быструю,

•Хлоропласты

2 0 Н - - * Н 2 0 . + 4-о2

2 Н + + 0 2 - > Н 2 О г СН3 СН2 ОН + Н 2 О г -> СН3 СНО + 2На О

СН3СН2ОН + 4-Q, - vCH 3 CHO+ Н 2 0 .

Итак, при наличии окисляемого в присутствии хлоропластов вещества •(этанола) и перекиси вместе с каталазой, действующей в роли перексидазы, на свету в итоге наблюдается поглощение 0 2 .

на ед. Хл. Аврон [192] при освещенности 200 000 як в присут­ ствии ФМС добился скорости синтеза АТФ 2500 мкмоль на 1 мг Хл в 1 ч.

В отношении точной локализации «входа» ФМС в ЭТЦ в ка­ честве донора электронов полной ясности не имеется. Поскольку катализируемое ФМС фосфорилирование не ингибируется, а да­ же стимулируется диуроном или офенантролином, на основании многих работ, начиная с [158], сделан вывод, что ФМС вызы­

в концентрации ниже Ю - 5 М восстанавливают Цит / [599, 830]. При высоких концентрациях ФМС непосредственно реагирует с ФС-І [1003, 599, 1004,565].

Донорами электронов для ФС-І могут служить также восста­ новленный триметилхинон [941] и тетраметилпарафенилендиамин [917, 976]. Требст с соавт. [920], Шварц [853], Весселс [976], Изава [533], изучая возможность фосфорилирования при использовании производных фенилендиамина и индофенола, по­ лучили довольно противоречивые результаты. Экспериментально доказано, что электронодонорная смесь АК. + ТМФД действует так же, как А К + ДХФИФ. Однако первая смесь, в отличие от второй, не способна стимулировать ФФ, сопряженное с транспор­

Изава с соавт. [533] подробно рассмотрели реконструирован­ ную ЭТЦ в хлоропластах, опосредуемую, по всей видимости, одной ФС-І при наличии искусственных доноров электрона. Если с хлоропластами в систему добавляли АК и промежуточный до­ нор электронов ДХФИФ или производное фенилендиамина вмес­ те с аутоксидабельным акцептором электрона (например, метил-

щества одновременно являлись и катализаторами. Эту реакцию можно превратить в реакцию Мелера: скорость поглощения кис­ лорода уменьшалась вдвое при внесении каталазы в систему, но снова восстанавливалась, если добавляли этанол. Зависимость данной реакции от ФС-І доказывается действием ДК-света и не­ чувствительностью к диурону. Эта система не зависит от добав­ ления Фд, Фп и НАДФ+, хотя отражает ту часть ЭТЦ, которая ответственна за восстановление НАДФ+.

Изава с соавт. специально рассматривали функцию доноров. В качестве доноров электронов на вход ФС-І использовали 2,3,5,6-тетраметил-п-фенилендиамин (2,3,5,6-ТМФД), N,N,N'N'- тетраметил-п-фенилендиамин (Ы,Ы,Ы'Ы'-ТМФД) и тетрахлоргидрохинон. На образование АТФ они влияли по-разному.