книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

щения и дисперсии оптического вращения глобулярных белков в водных растворах и растворах, насыщенных углеводородом, позволило сделать вывод, что солюбилизированный углеводород практически не изменяет содержания спиральных структур в гло­ булах белков. Влияние солюбилизации углеводорода на устойчи­ вость глобулярных белков к тепловой денатурации изучалось на примере яичного альбумина при pH 7,2, химотрипсина при pH 4,25 и у-глобулина при pH 9,2 — по изменению удельного оптического вращения. Тепловая денатурация у-глобулина при pH 9,2 оценивалась также спектрофотометрически, а тепловая денатурация трипсина при pH 3,75 — по снижению ферментатив­ ной активности.

На рис. 9 представлена зависимость удельного оптического вращения от температуры для чистого раствора яичного аль­ бумина и раствора, солюбилизировавшего бензол. Из рисунка видно, что резкий подъем кривой 1 начинается с 60°, а кривой 2 — с 70° С. Таким образом, молекулы яичного альбумина, солю­ билизировавшие бензол, становятся более устойчивыми к тепловой денатурации [116]. Аналогичные закономерности получены для растворов а-химотрипсина (рис. 10).

Влияние солюбилизации бензола на тепловую денатурацию химотрипсина изучалось также по изменению удельного оптиче­ ского вращения во времени при 60° С (рис. 10,6). Скорость денату­ рации химотрипсина при 60° С в отсутствие бензола значительно больше скорости денатурации а-химотрипсина, насыщенного бен­ золом. Скорость денатурации чистого а-химотриисина, измеряе­ мая по изменению удельного оптического вращения, составляет 0,05—0,07 град/мин, тогда как с бензолом — 0,01 град/мин. Эти результаты также показывают, что вследствие солюбилизации углеводорода глобулы белков приобретают дополнительную устой­ чивость к тепловой денатурации.

30

Природа углеводородов заметно влияет на повышение устойчи­ вости белков к тепловой денатурации [161]. Особенно ярко это проявилось при исследовании тепловой денатурации у-глобулина, отличительной чертой которого является наличие резкого плав­ ления вторичной структуры при повышении температуры [162]. Температура конформационного перехода у-глобулина в водном растворе при pH 9,2 равна 63°, в присутствии гептана 67°, декана и тетрадекана 66° С. Таким образом, в результате насыщения глобулы белка углеводородом температура денатурации повышает­ ся на 3—4°.

Рис. 9. Зависимость удельного опти­ ческого вращения раствора яичного альбумина до (1) и после насыще­

ния бензолом (2) от температуры

(с = 0,55 8/100 мл\ pH 7,2)

Рис. 10. Зависимость удельного оп­ тического вращения раствора а-химо- тринсина до (1) и после (2) насыще­ ния бензолом от температуры (а) и

времени выдерживания (б) при с = 0,5 г/100 мл\ pH 4,25 и 60° С

В

Ь

На основании результатов исследования тепловой денатурации у-глобулина по изменению удельного оптического вращения и оп­ тической плотности при разных температурах [161] были опреде­ лены изменения энтальпии конформационных переходов {АН). Полученные величины АН показывают, что связывание углеводо­ родов белками приводит к увеличению теплоты денатурации или, что то же самое, к повышению устойчивости нативной глобуляр­ ной конформации белка по отношению к денатурации теплом. При этом связывание у-глобулином гептана увеличивает теплоту де­ натурации на 10 ккал/молъ (от 55 до 65 ккал/молъ), связывание декана и тетрадекана — от 55 до 57 ккал/молъ. Этот факт очень хорошо объясняется особенностями заполнения глобул белка этими углеводородами, что будет рассмотрено ниже. Спектрофото­ метрическое исследование тепловой денатурации у-глобулина также показало повышение устойчивости молекулы белка в ре-

31

зультате связывания гептана на 10 ккал/молъ. Эти результаты, полученные разными методами, показывают, что повышение устой­ чивости нативной глобулярной конформации находится в непос­ редственной зависимости от степени заполнения гидрофобных областей глобулы белка углеводородом.

В работе [163] исследовалась тепловая инактивация трипсина при разных температурах (37—50° С). Для изучения влияния углеводородов на тепловую инактивацию трипсина растворы фермента предварительно насыщались углеводородами при 4° С.

выдерживались под слоем углеводорода.

Исследования показали, что предельные углеводороды значи­ тельно увеличивают АН тепловой инактивации трипсина (от 62 для чистого трипсина до 74 ккал/молъ в присутствии додекана). Таким образом, при связывании углеводородов глобулярными белками в водных растворах температура денатурации возрастает на 4—10°, а энтальпия денатурации увеличивается на 2— 10 ккал/молъ. Повышение термостабильности глобул белка зависит как от степени заполнения гидрофобных областей молекулами углеводородов, так и от природы углеводорода и связывающей неполярной области.

Вывод, сделанный на основании рассмотренных результатов физико-химических исследований, характеризующих воздействие углеводородов на структуру белков, подтвердился и при изучении влияния углеводородов на биологическую активность ферментов (на примере некоторых протеаз). Углеводороды, солюбилизиро­ ванные ферментами, тормозят протеолитические реакции пепсина, химотрипсина и трипсина. Однако углеводороды не влияют на максимальную скорость гидролиза, а лишь увеличивают констан­ ту Михаэлиса. Эти результаты, а также литературные данные позволяют сделать вывод о том, что углеводороды, являясь кон­ курентными ингибиторами протеолитических ферментов, сущест­ венно не изменяют их структуры [163, 164].

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СОЛЮБИЛИЗАЦИЮ УГЛЕВОДОРОДОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ СВЯЗЫВАНИЯ

Попытаемся на основе энергетических оценок процесса солю­ билизации углеводородов в водных растворах белков разобраться в механизме этого явления. Рассмотрим результаты определения связывания углеводородов белками при разных температурах. Независимость от температуры процесса связывания углеводоро­ дов предельного ряда сывороточным альбумином показывает, что энтальпия связывания мала и, следовательно, повышение раство­ римости этих углеводородов обусловлено возрастанием энтропии

32

[166—169]. Подобный же эффект наблюдался при растворении этих углеводородов в мицеллах додецилсульфата натрия [169, 170].

При исследовании природы мест связывания бутана и пентана Р-лактоглобулином автор [168] нашел, что в процессе связывания термодинамические параметры меняются следующим образом.

Связывание бутана сопровождается изменением свободной энергии AF = — 6,4 ккал/молъ, изменением энтальпии АН = = — 1,1 ккал/молъ и изменением энтропии AS = 17,8 кал/моль -град.

Перенос бутана в мицеллу додецилсульфата натрия характери­

пентана в мицеллу додецилсульфата натрия сопровождается из­ менениями AF — — 5,8 ккал/молъ, АН = 1 ,1 ккал/молъ, AS = = 15,8 кал/моль-град. Эти данные показывают, что участки связывания углеводородов белками должны быть гидрофобными и очень похожими на ядро мицеллы мыла. Нами изучалась солю­ билизация углеводородов в водных растворах лизоцима, трипсина, а-химотрипсина при различных температурах от 10 до 40° С [163].

Температурная зависимость растворимости углеводородов (алифатичес­ ких и ароматических) в воде представлена в табл. 5. [161]. Выше упомина­ лось, что системы углеводород — вода являются простейшими моделями для изучения гидрофобных взаимодействий. Однако изучены, такие системы мало и имеющиеся сведения не систематизированы для широких интервалов температур. Наиболее подробный обзор приведен в работе [171].

Увеличение размеров углеводородов приводит к уменьшению их растворимости в воде. Особенно ярко эта зависимость выра­ жена в ароматическом ряду. Этот эффект удовлетворительно объяс­ няется с точки зрения модели воды, предложенной Немети и Ше-

рагой [8—18]. Наблюдаемый излом па кривой зависимости рас­ творимости от длины цепи углеводородов при Сп [172] авторы объяснили тем, что высшие алканы растворяются не молекулярно,

аобразуют агрегаты.

Сповышением температуры растворимость ароматических уг­

леводородов обычно увеличивается. Для алифатических углево­ дородов тенденция к увеличению растворимости с повышением температуры уменьшается с увеличением длины молекулы угле­ водорода.

Растворимость углеводорода при 10—40° G в растворах гло­ булярных белков представлена в табл. В—8.

Данные табл. 6—8 показывают, что связывание углеводоро­ дов белками практически не меняется в интервале 15—30° С. Неизменность связывания в этом интервале температур свиде­ тельствует о неизменности состояния гидрофобных областей бел­ ков в данных условиях. При понижении температуры ниже 15° и повышении выше 30° С для алифатических углеводородов наблю­ дается уменьшение связывания.

Многими исследователями показано, что изменение температу-, ры не сильно влияет на связывание дифильных молекул белками [143, 173—178]. В работе [175] указывается, что температурный коэффициент связывания каприлата натрия сывороточным альбу­ мином равен нулю. Значения, полученные для теплот связывания сывороточным альбумином ионов ароматических сульфатов нат­ рия и алкилсульфатов натрия [176], во всех случаях также очень малы. Так как AjPh ДН малы, то сродство альбумина к этим ионам, объясняется в первую очередь положительными изменениями энт­ ропии. По представлению Клотца [177], увеличение энтропии при образовании комплекса между двумя отдельными частицами ука­ зывает на то, что растворитель играет главную роль в этом про­ цессе.

Процесс солюбилизации углеводородов можно рассматривать как процесс распределения третьего компонента между двумя

34

Таблица 7. Избыток растворимости углеводородов (S , г/100 м л )

в растворах сывороточного альбумина (1), pH 4,6, у-глобулина (2), pH 7,05

2* 35

несмешивающимися фазами. Такой подход позволяет вычислить константу распределения К1 углеводорода между водой и белком и оценить изменение свободной энергии при связывании углево­

0,75 г/см8). Данные по температурной зависимости Кх позволяют определить изменение энтальпии процесса по уравнению ВантГоффа

П р и м е ч а н и е . ДН = 0.

36

Солюбилизация углеводородов в растворах глобулярных бел­ ков (см. табл. 9 и 10) сопровождается небольшими отрицательны­ ми изменениями свободной энергии и является, следовательно, са­ мопроизвольным, термодинамически выгодным процессом.

Сравнение величин AF, АН и AS солюбилизации с аналогич­ ными величинами для процесса переноса углеводородов в непо­ лярную среду [эти величины равны по величине и обратны по знаку соответствующим величинам процесса переноса углеводоро­ дов из неполярной среды в воду (см. табл. 10)] убедительно пока­ зывает, что фаза, в которую углеводород перераспределяется из воды, неполярна, а процесс солюбилизации аналогичен процессу переноса неполярной молекулы из водной среды в неводную гид­ рофобную.

Изменения свободной энергии при взаимодействии ароматиче­ ских углеводородов с а-химотрипсином и трипсином представле­ ны в табл. 11.

Таблица И. Изменение A F ( и к а л ! м о л ь ) при

солюбилизации углеводородов в растворах трипсина и а-химотрипсина

У г л е в о д о р о д а -Х п м о т р и п с и п Т р и п с и н

П р и м е ч а н и е . Цифры в скобках — данные, получен­ ные Кеннеди с сотр. [180—182].

Полученные величины AF при взаимодействии ароматических углеводородов с а-химотрипсином хорошо согласуются со значе­ ниями, найденными при кинетических измерениях константы ингибирования ароматическими углеводородами а-химотрипсина в реакции гидролиза метилового эфира гиппуровой кислоты

[179-182].

При переносе неполярной молекулы из воды в гидрофобную среду изменение свободной энергии, приходящееся на одну СН2-группу, как известно, уменьшается на 800 кал. В случае солюбилизации углеводородов изменение свободной энергии на одну СН.2-группу в гомологическом ряду гораздо меньше. При переносе углеводорода из воды в неполярную среду основной вклад в изменение AF вносит взаимодействие углеводорода с во­ дой, которое, согласно теории Немети и Шераги, зависит от при­

37

роды углеводорода. Причем чем больше длина углеводородного радикала, тем больше изменение свободной энергии переноса. Однако белковая фаза не совсем подобна неполярной среде, так как взаимодействие ее с молекулами углеводорода определяется природой и размерами гидрофобных областей и, как будет пока­ зано выше, уменьшается с увеличением молекулярного объема

углеводорода.

Другими авторами также отмечалось, что движущей силой образования комплексов белка с неполярным веществом является перенос неполярного компонента из воды в неполярные области белка. Так, в работе [179] за меру гидрофобности соединения для характеристики связывания белками берется коэффициент его распределения между водой и октиловым спиртом. При изучении связывания различных соединений бычьим гемоглобином оказа­ лось, что связывание описывается уравнениями, сходными с уравне­ ниями распределения этих соединений между водой и октиловым спиртом. Это свидетельствует о том, что места связывания по неполярности близки к октиловому спирту, однако являются, по-видимому, несколько более полярными.

Таким образом, приведенный анализ связывания показывает, что солюбилизация углеводородов белками в значительной мере обусловлена возрастанием энтропии, что соответствует статисти- ческо-термодинамической модели гидрофобного связывания [8] и подтверждает выбранную нами модель распределения углеводо­ родов при солюбилизации между двумя фазами.

ОЦЕНКА ГИДРОФОБНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ СОЛЮБИЛИЗАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ

Гидрофобный характер механизма солюбилизации, вытекающий из оценок термодинамических параметров, взаимосвязь структур­ ных изменений белка с изменением величины солюбилизации, а также мягкое воздействие связанного углеводорода на структу­ ру белка, отмеченные в предыдущих разделах, по-видимому, означают, что исследование солюбилизации углеводородов может стать методом характеристики гидрофобной структуры белка.

Выявление связывающей способности белков по отношению к углеводородам различной природы представляет интерес и с точ­ ки зрения изучения общих закономерностей образования комплек­ сов^белок—лиганд. Вишниа и Пиндер [165, 166, 183] дали подроб­ ный анализ предлагаемых в литературе механизмов связывания углеводородов белковыми молекулами и также пришли к выводу, что в структуре глобулярных белков имеются гидрофобные обла­ сти (объемы), где и локализуются молекулы углеводородов. Хоро­ шо известно, что для определения локализации и роли отдельных функциональных групп белка имеются подробно разработанные

мэтодики. Однако не существует удовлетворительных методов

38

изучения гидрофобной структуры белков. Хотя в ряде работ делались попытки количественной оценки степени гидрофобности и ее связи со структурой и свойствами белковых молекул [103— 115, 169, 184], вопрос о гидрофобной структуре белка далек от разрешения. Особенный интерес с этой точки зрения представляет исследование при постоянных pH и температурах солюбилизации гомологических рядов алифатических или ароматических углево­ дородов.

В качестве примера приведем анализ гидрофобной структуры глобулярных белков (числа связывающих областей и их емкости), проведенный в работах [116, 123—127, 185], на основе сопоставле­ ния объемов гидрофобных областей белковых глобул с молекуляр­ ными объемами углеводородов, способных разместиться в этих областях [163, 186—191].

Изучалась растворимость и солюбилизация 15 углеводородов в воде и растворах у-глобулина, сывороточного альбумина человека (ЧСА), лизоцима. В качестве углеводородов использовали гомологи алифатического ряда — гептан, октан, ноная, декан, додекан, тридекан, тетрадекан, пентадекан и ароматического — бензол, толуол, n-ксилол, этилбензол, изопропилбензол, а также сквалан (С24Н4 (СН3)6) и циклогексан. Результаты исследований представ­ лены в табл. 12. Прежде всего необходимо отметить, что для всех изученных белков величина связывания зависит от молекулярного объема углеводорода (в случае лизоцима зависимость выражена нечетко). Увеличение длины цепи нормального парафина или алкильной группы у бензольного ядра приводит к значительному уменьшению солюбилизации, что согласуется с результатами работы [105]. Качественный характер зависимости величины связывания углеводородов от молекулярного объема аналогичен для ароматических и парафиновых углеводородов. Однако, как хорошо видно из табл. 12, связывание углеводородов ароматиче­ ского ряда существенно меньше связывания парафинов при рав­ ных объемах молекул.

Связывание углеводородов определяется не только их разме­ рами, но и пространственным строением, а также природой гидро­ фобных областей. Наглядное доказательство этого можно полу­ чить, проанализировав данные по связыванию различных углево­ дородов у-глобулином и сывороточным альбумином. Так, молекулы изопропилбензола, имеющие приблизительно равные объемы с гептаном, связываются белками различно, а связывание гептана и толуола одинаково, хотя объем молекулы гептана больше моле­ кулярного объема толуола. В то же время молекулы циклогексана и толуола, имеющие одинаковые молекулярные объемы и, повидимому, сходное пространственное строение, связываются у-глобулином и сывороточным альбумином в равных количествах.

Сравнение величин связывания углеводородов у-глобулином, сывороточным альбумином и лизоцимом показывает, что связы­ вающая способность сывороточного альбумина по отношению к «ма-

39