книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

Для выяснения роли S—S-связей в образовании пространст­ венных структур казеина нами использовались реагенты, разру­ шающие и блокирующие эти группы (хлорная ртуть и натрий сер­ нистокислый) (рис. 39, кривые 3 и 4). Введение рассчитанных коли­ честв этих веществ мало понижало прочность пространственных структур по сравнению с прочностью без добавки этих реагентов, что указывало на незначительную роль S—S-связей в образова­ нии пространственных структур. Этого и следовало ожидать на основании их малого содержания в казеине (0,34 г цистина на 100 г казеина), на этом основании объяснение Вормелем [275] образова­ ния пространственной структуры за счет S—S-связей представ­ ляется неверным.

Доказательством некоторой роли гидрофобных (обратимых) свя­ зей в образовании структур казеина является также частичное тиксотропное восстановление (на 50%) их первоначальной проч­ ности системы после механического разрушения (разрушение про­ водилось в вибромельнице). Таким образом, на основании класси­ фикации пространственных структурированных систем, данной Ребиндером, структуру, возникающую в системе казеин — вода, можно определить как коагуляционно-конденсационную [253].

Температурно-временная зависимость прочности гелей казеина. В последние годы стали известны многие факты, показывающие, что напряжение не является единственным фактором, вызы­ вающим механическое разрушение [283]. Оказалось, что при за­ данном напряжении прочность зависит от длительности пребыва­ ния исследуемого материала в напряженном состоянии. Как пра­ вило, образец, разорванный за короткое время, обнаруживает повышенную прочность по сравнению с таким же образцом, разор­ ванным медленно. Временная зависимость прочности при стати­ ческой нагрузке, получившая название статической усталости материала, наблюдалась многими исследователями. Такое яв­ ление было обнаружено в силикатных стеклах, пластмассах, ме­ таллах.

Систематическое исследование зависимости времени до разру­ шения от величины приложенного напряжения для полимеров, проведенное в работах Журкова и сотр. [284—287], показало, что разрушение является следствием необратимых изменений материа­ ла, скорость накопления которых определяется величиной при­ ложенного напряжения, температурой и строением вещества. Было показано, что между временем до разрыва, т. е. долговечностью т исследуемого материала под нагрузкой, разрывающим напряже­ нием сг и абсолютной температурой Т имеется однозначная связь:

(28)

где т0 — предэкспоненциальный множитель; UQ— истинная (на­ чальная) энергия активации процесса разрушения; у — структур­ ная постоянная, к — константа Больцмана.

120

При испытании с постоянной температурой формула (28) упро­ щается:

По Журкову, процесс разрушения твердого полимерного тела не чисто механическое явление, а рассматривается как термичес­ кий процесс распада полимерных молекул, в котором за счет теп­ ловых флуктуаций преодолевается энергетический барьер U0, сни­ женный в результате действия механического напряжения на ве­ личину уи.

Таким образом, основной характеристикой сопротивления ма­ териала как при статической, так и при динамической нагрузке служит механическая долговечность, т. е. время от момента при­ ложения нагрузки до момента разрушения. В многочисленных ра­ ботах, рассмотренных в обзорной статье Аскадского [283], показа­ но, что существование временной зависимости прочности наблюда­ ется для всех твердых тел и связано с самой природой разрушения. Эти работы подтвердили основное положение флуктуационной тео­ рии прочности, согласно которой разрушение полимерных и дру­ гих твердых тел происходит во времени вследствие распада кон­ тактов и химических связей под действием нагрузки. Недавние ис­ следования Влодавца и сотр. и Стратулата [288, 289] указали на «принципиальную возможность использования измерений долго­ вечности при изучении механических свойств не только монолит­ ных твердых тел, но и дисперсных коагуляционных и конденса­ ционных структур».

Для определения энергии активации процесса разрушения ге­ лей казеина нами изучалась температурно-временная зависимость прочности 18%-ного геля казеина при температурах 14, 22, 30 и 40° С и pH 12,0.

Для этого к пластинкам с рифленой поверхностью 2 x 5 см2, погруженным в кюветы с гелями казеина, прикрепляли нити, пере­ кинутые через тефлоновые блоки, а с другого конца к нитям при­ кладывалось напряжение. Принцип метода заключался в измере­ нии времени от момента приложения нагрузки до того момента, когда пластинка вырывалась из образца. Найденные из опыта зависимости времени до разрушения от нагрузки при указанных температурах представлены на рис. 39—41.

На рис. 39 представлена зависимость логарифма долговечности конденсационно-коагуляционной структуры геля казеина от при­ ложенного напряжения при четырех различных температурах. За­ висимость носит практически линейный характер, как и обычно при определении долговечности твердых тел под действием постоян­ ных растягивающих напряжений [284, 288]. Характер изменения линейных зависимостей (см. рис. 39) показывает, что разрушение

121

структуры геля казеина при действии постоянного напряжения сдвига является термоактивационным процессом.

Полученные зависимости хорошо описываются уравнением

(30)

где т — долговечность; Рт и Т — постоянное напряжение и абсо­ лютная температура испытания; U0 — истинная энергия актива­ ции процесса разрушения; у — структурная постоянная; R — универсальная газовая постоянная; т0 — предэкспоненциальный множитель.

Эта формула отличается от известной формулы Журкова лишь тем, что вместо нормальных напряжений Ра в нее входят сдвиго­ вые — Рт.

Как видно из сравнения кривых 1—4 рис. 39, температура не очень сильно влияет на долговечность при постоянных напряже­ ниях сдвига. Так, например, долговечность при напряжении сдви­ га 60 Г/см2, измеренная при 14° С, превышает долговечность той же структуры при 40° С лишь на 2 порядка. Это изменение мало по сравнению с изменениями для других сходных структур (например для конденсационной структуры геля поливинилового спирта

[289]).

Значение энергии активации разрушения конденсационно-коа­ гуляционной структуры геля казеина определялось двумя путями.

По первому из них путем экстраполяции прямых рис. 40 опре­ делялись значения долговечности при нулевом напряжении сдвига lg тр = 0. Затем строился график зависимости этой величины от 1/ Т. Из наклона полученной прямой определялось значение энер­ гии разрушения данной структуры по формуле

(31)

Другой путь основывался на расчете U0по формуле U0 — yPi= = 2,3 R T (lg т — lg т0), которая вытекает из формулы (30). Ве­ личину т0 или минимальную долговечность определяли из построе­ ния графика зависимости lg т от обратной температуры для раз­ личных постоянных напряжений сдвига. Точка пересечения общего пучка веерообразных прямых с осью ординат дает значение lg т0 (рис. 40). В нашем случае минимальная долговечность оказалась равной 10-12 сек. Для каждого значения приложенного напряже­ ния сдвига Pi по формуле (30) рассчитывали величину U = U0 —

—у Pi. Затем строился график зависимости U = / (Рт) и экстрапо­ ляцией к значению Рт = 0 находилась £/0 (рис. 41).

Величина структурно-чувствительного фактора у (объема активации) была определена из зависимости U = / (Pi) как

у = — dU/dPi.

Для 18% геля казеина найденные значения параметров урав­ нения Журкова следующие: 1) энергия активации разрушения

122

равна 26 -ь 37 ккал1молъ; 2) структурно-чувствительный фактор 0,22 м3/молъ; 3) предэкспоненциальный множитель 10-12 сек [290].

Значения параметров U0 и т0 оказались близкими к найденным при изучении долговечности твердых тел [284, 287]. Это совпадение может свидетельствовать о том, что при разрушении конденсацион­ но-коагуляционной структуры гелей казеина возможно происходит также разрушение межатомных химических связей, энергия акти­ вации разрушения которых составляет десятки килограммкалорий на моль. Это разрушение происходит за время, равное периоду

Ц ер*0(сею

Рис. 40. Зависимость лога­ рифма времени до разруше­ ния геля казеина (с = 18

г/100 мл; pH 12,0) от абсо­

лютной температуры при постоянных значениях Рх

1 — Р х = 120; 2 — 100;

3 — 80; 4 — 50 Г/см*

U,икая/моль

Рис. 41. Зависимость энер­ гии активации разрушения геля казеина (с = 18 г/100 мл; pH 12,0) от приложен­

ного напряжения сдвига

123

колебания атомов в цепочке полимерной молекулы (10-12 — 10~13

сек).

Значение структурно-чувствительного фактора у оказалось на 2—3 порядка больше обычного значения этого фактора для твер­ дых тел. Коэффициент у, имеющий размерность объема, обычно ин­ терпретируется как тот объем, на который должно увеличиться твердое тело, чтобы разрушиться под действием одного только приложенного напряжения Р ,. Вопрос о физическом смысле струк­ турно-чувствительного фактора еще окончательно не решен. Воз­ можно, необычно высокое значение у для структур гелей казеина связано с размерами частиц, образующих структурную сетку геля.

Структурообразование

вводных растворах яичного альбумина

всвязи с конформационными переходами

вмакромолекулах

Вработе Буланкина и Силина [291] было показано, что нри под-, кислении и подщелачивании нативные белки, обладающие глобу­ лярной структурой, необратимо перестраиваются в белки фибрил­

лярного типа. Последнее обстоятельство может иметь определенное значение для понимания ряда структурно-физических особеннос­ тей протоплазматических образований. Майерс и Франс [292] по­ лучали гели яичного альбумина при добавлении уксусной кислоты. Они считали, что гель получается в результате образования водо­ родных связей между уксусной кислотой и белком, кроме того, ими было показано, что эти гели тиксотропны. Доннели [293] получил гели яичного альбумина при добавлении щелочи; им было замечено, что такие гели разжижаются тем скорее, чем больше было введено щелочи. Иергенсонс [294] получал гели яичного альбумина в при­ сутствии различных солей и спиртов и изучал время застуднева­ ния по перевертыванию пробирки. Им отмечалось также, что гели тиксотропны. Кензел с сотр. [295] исследовал процесс денатура­ ции яичного альбумина по изменению удельного оптического вра­ щения и вязкости и обратил внимание на то, что в присутствии мо­ чевины и щелочи образуются гели яичного альбумина.

Кунингам [296] изучал влияние pH (количества добавленной щелочи) на время образования геля яичного альбумина. Он пока­ зал, что щелочные гели со временем плавятся, причем тем скорее, чем выше pH геля. Титрование щелочного геля показывает увели­ чение содержания аминного азота с ростом pH. В другой работе Кунингам и Коттерел [297] исследовали время образования кислых гелей яичного альбумина и нарастание относительной вязкости в процессе гелеобразования. Янике [298] удалось получить гели яичного альбумина не только в сильно кислой или щелочной среде, а при pH 4,7—10,8 при добавлении мочевины. Гели яичного альбу­ мина можно получить при высоких давлениях вследствие денату­ рации макромолекул [299]. Несмотря на большое число работ,

124

посвященных изучению гелеобразования, ряд проблем, связанных с механизмом этого процесса, остается еще невыясненным. Во всех перечисленных работах только указывалось на образование геля, но механические свойства гелей яичного альбумина не ис­ следовались.

Прежде чем начать изучение структурообразования в растворах яичного альбумина, исследовались конформационные изменения макромолекул в его растворах при условиях денатурации (при pH < < (3 и pH )> 10), которые приводят к гелеобразованию. На осно­ вании этих конформационных исследований и были выбраны наи­ более подходящие условия для исследования структурообразова-

Рк.Г/сй*

Рис. 42. Изменение прочности в гелях яичного альбумина, полученных нри 20° С (а), 55° С (б) и pH < 3, во времени при различных концентрациях

1 — 4,0; 2 — 5,06; 3 — 6,4 г/100 мл

125

ния в водных растворах яичного альбумина. На рис. 42, а представ­ лены результаты исследования нарастания прочности (методом тан­ генциально смещаемой пластинки) в водных растворах яичного альбумина при комнатной температуре. Видно, что процесс гелеобразования протекает в два этапа: индукционный период, в те­ чение которого прочность системы остается очень малой, затем на втором этапе прочность системы постепенно нарастает, достигая своего наибольшего значения порядка 8000 дин/см2. Продолжи­ тельность индукционного периода структурообразования уменьша­ ется с увеличением концентрации, одновременно растет и проч­ ность структуры, так как с увеличением концентрации происходит рост числа контактов межмолекулярных пространственных связей в единице объема.

Как уже указывалось, процесс денатурации яичного альбумина под действием кислоты и щелочи можно ускорить нагреванием. Да рис. 42, б представлено нарастание прочности гелей яичного аль­ бумина примерно при тех же концентрациях и pH, но при темпера­ туре 55° G. Видно, что индукционный период при этом сокраща­ ется. Максимальная прочность для этих концентраций остается практически без изменения при 20 и 55° С.

Рис. 45. Изменение прочности (1) и удельного оптического вращения (2) в гелях яичного альбумина во времени (с = 6,6 г/100 м л; pH > 10, 20° С)

Рис. 46. Зависимость максимальной прочности гелей яичного альбумина от концентрации (pH 3,1)

1 — 20° С; 2 — 55» С

Из рис. 43 следует, что процесс гелеобразоваяия сопровожда­ ется конформационным изменением макромолекул яичного альбу­ мина, которое сводится к разрушению глобул и образованию межЪюлекулярных связей, обусловливающих прочность гелей.

При гелеобразовании при 55° С (см. рис. 42, б, кривые 2, 4) обнаружено новое явление, заключающееся в том, что при концент­ рациях белка больше 4,5 г/100 мл процесс нарастания прочности

126

проходит черзз максимум. Гель самопроизвольно растрескивается, что, вероятно, связано с возникновением внутренних напряжений в процессе тепловой денатурации белка. При быстром образовании геля возникает каркас трехмерной структуры и вместе с тем про­ должает идти процесс денатурации, поэтому рвутся уже ранее об­ разовавшиеся связи. Действительно, если образование геля

Рк,Г/СМ2

Рис. 47. Изменение прочно­ сти гелей яичного альбуми­ на после механического раз­ рушения (pH < 3 ; 20° С)

для различных концентра­ ций

1 — 2 , 1;

2 — 3,1 г/100 мл

происходит медленно при кислотной денатурации и 20° С (см. рис. 42, а), то прочность возникшей структуры со временем не уменьшается.

Развитие пространственной структуры геля яичного альбумина (pH О 10) представлено на рис. 44. Прочность возникает сразу же, достигая максимального значения в течение малого промежутка времени, а затем происходит самопроизвольное плавление геля, которое сопровождается выделением аммиака. Из рис. 45 видно, что в щелочной области процесс гелеобразования также сопровож­ дается конформационными превращениями молекул яичного аль­ бумина — удельное оптическое вращение увеличивается до опре­ деленного значения и далее не изменяется. Плавление геля не сопровождается дальнейшим изменением удельного оптического вращения. Исследование концентрационной зависимости макси­ мальной прочности структур в растворах яичного альбумина пока­ зало, что минимальная концентрация белка, способная образовать пространственную структуру, при pH <^3 больше 2 г/100 мл, а при pH О 10 больше 3,5 г/100 мл. Результаты представлены на рис. 46, из которого видно, что кривая зависимости Рк от концентрации имеет параболический вид.

Прочность геля яичного альбумина обусловлена межмолекуляр­ ными взаимодействиями, которые определяются различными типа­ ми связей: водородными, гидрофобными, электростатическими. Электростатические взаимодействия между полярными группами, возможность которых заложена в самой природе белка, в данном случае исключались, так как структуры образовывались в сильно­ кислой и сильнощелочной областях. Для выяснения роли водород­ ных связей в образовании прочности структур в водных гелях яичного альбумина использовались реагенты, разрушающие их, а

127

именно: салициловокислый натрий и мочевина. Добавки 8 М ра­ створа мочевины к раствору яичного альбумина концентрации 5,6 г/100 мл при pH < 3 и 20° С не приводили к возникновению структуры. Добавка к этому же раствору 10%-ното раствора салицилата натрия лишь незначительно понижала прочность воз­ никшей структуры. Эти опыты показали, что гидрофобные связи в основном и обусловливают прочность структуры. Кроме того, тот факт, что при 55° С образуются прочные гели яичного альбумина, свидетельствует о важной роли гидрофобных взаимодействий в образовании структуры. В работе [300] делается вывод о том, что кислые гели образуются без участия S—S- и S—Н-связей и что гелеобразование есть чисто физический процесс.

Для выяснения типа структуры геля яичного альбумина иссле­ довалось нарастание прочности после механического разрушения. Результаты приведены в табл. 12 и на рис. 47. Видно, что после повторных разрушений прочность практически полностью восста­ навливается во времени.

Таблица 12. Результаты исследования тиксотропных свойств

Таким образом, в гелях яичного альбумина возникает слабая структура, подобная обычным тиксотропным коагуляционным структурным сеткам, в которых частицы дисперсной фазы или агрегаты макромолекул связаны ван-дер-ваальсовыми силами, дей­ ствующими между углеводородными гидрофобными группами мо­ лекул яичного альбумина при денатурации белка [301, 302].

К МЕХАНИЗМ У СТРУКТУРООБРАЗОВАНИЯ

ВБЕЛКОВЫХ СИСТЕЩАХ

Всоответствии с принципами физико-химической механики об­

разование пространственных дисперсных структур в белковых сис­ темах следует рассматривать во времени в процессе развития струк­ туры на разных уровнях организации макромолекул белка с уче­ том их конформационных особенностей и процессов образования новой лиофильной дисперсной фазы. Это образование новой фазы происходит в биополимерных системах из пересыщенных раство­ ров путем создания контактов между частичками, приводящих к

128

появлению объемной структуры геля, характеризующейся твердо­ образными механическими свойствами.

На примере гелей желатины (концентрация 1 г/100 мл) показа­ но, что прочность геля при 20° С нарастает во времени и достигает предельного значения через 3—4 суток (рис. 48, а). В начале про­ цесса гелеобразования обнаружен индукционный период (4 час), в течение которого не наблюдается нарастания сдвиговой прочности, но данные по светорассеянию (кривая 1) и удельному оптическому вращению (кривая 2) показывают, что в это время в системе про­ текают конформационные изменения макромолекул желатины и

Рис. 48. Изменение светорассеяния (1), удельного оптического вращения (2) и предельного напряжения сдвига (3) во времени для геля желатины

(с = 1 г/100 мл) при pH 4,9 и 20° С (а) и 6° С (б)

процесс агрегации (выделение частиц новой фазы). К моменту воз­ никновения и резкого нарастания прочности пространственной структуры около 50% всех макромолекул желатины образуют кол­ лагеноподобные спирали и выделяются в виде новой дисперсной фазы. Дальнейшее нарастание прочности происходит одновремен­ но с процессом агрегации макромолекул и их дальнейшей спирализацией. Для возникновенця прочной структуры геля необходимо образование агрегатов из макромолекул, т. е. наличие в системе определенной концентрации фазовых частиц.

Если создать условия для более быстрого выделения фазы путем увеличения пересыщения в растворе (например понижением тем­ пературы опыта, рис. 48, б), то нарастание прочности геля проте­ кает без заметного индукционного периода. Из рис. 48 видно, что на кинетических кривых изотермического нарастания светорассея­ ния отсутствует индукционный период, характерный для образо­ вания новой кристаллической фазы из пересыщенных растворов. Скорость нарастания светорассеяния увеличивается с понижением температуры, т. е. с увеличением пересыщения раствора. Отсутст­ вие индукционного периода в изменении светорассеяния в раство­ рах и гелях желатины свидетельствует о большой скорости разде­ ления системы на две фазы [303—305], которое не лимитируется