книги из ГПНТБ / Дертингер Г. Молекулярная радиобиология. Действие ионизирующих излучений на элементарные биологические объекты

и изучение спектров составных компонентов ДНК- Где только возможно, для опытов стараются использовать одиночные кри­ сталлы химических веществ. Такая методика позволяет иссле­ довать зависимость спектров ЭПР от ориентации. Кристалл вра­ щают в магнитном поле вокруг трех взаимно перпендикулярных осей, и расщепление спектра, в частности, измеряется как функ­ ция ориентации. В таком случае тензор сверхтонкого расщепле­ ния, как правило, специфичен для структуры радикалов. Некото­ рые радикалы составных частей ДНК, идентифицированные с помощью этого метода, представлены в табл. 12. Характерно, что все эти радикалы оснований образуются в результате при­

тия кольца. Поэтому понятно, что основания образуют меньше радикалов, чем нуклеозиды, а те, в свою очередь, меньше, чем нуклеотиды. Более высокий выход радикалов в нуклеозндах и нуклеотидах обусловлен дополнительной атакой атомов водоро­ да, которые отщепляются от остатка дезоксирибозы, т. е. не­ прямым эффектом, соответствующим уравнению (6.5). В дезокснрибозе вовсе не стабилизируется или стабилизируется очень незначительное количество радикалов, что резко контрастирует с картиной облучения свободных Сахаров.

Образование радикалов в результате присоединения водоро­ да к основаниям может быть непосредственно продемонстриро­ вано при действии на порошкообразный образец исследуемого вещества атомарного водорода, полученного при газовом раз­ ряде. При этом регистрируются спектры ЭПР, напоминающиеспектры облученных нуклеозидов [27]. Сходные сигналы ЭПР

ДНК. То, что этот процесс происходит в ДНК, а также в его

нал ДНК, полученный при комнатной температуре, не образуется простым наложением первичного спектра отдельных составных частей ДНК, но, как и в случае с ферментами (см. рис. 65), на него оказывают влияние эффекты перестройки.

В связи с этим вопрос о том, может ли энергия передаваться от одной цепи к другой посредством системы водородных связей в пределах двухцепочечной ДНК, представляет особый интерес. Шмидт и Снайпс [44] предприняли интересную попытку иссле­ довать эту проблему посредством ЭПР. Они при 77° К облучили

150

ный при нагревании образцов до комнатной температуры, был обязан своим происхождением почти целиком радикалу кольца тимина. Обработанная таким лее способом эквимолярная смесь двух соединений давала суммарный спектр сигналов аденина и тимина. Этот опыт доказывает возможность переноса энергии или спина через водородные мостики в кокристалле. Тем не менее на основании этих опытов нельзя утверждать, что пере­ нос энергии по водородным связям пар оснований действитель­ но происходит в молекуле ДНК. Однако небольшой вклад аде­ нина в спектр ЭПР ДНК, особенно в случае, когда наблюдается ярко выраженный сигнал тимина, можно рассматривать как сви­ детельство того, что механизм, осуществляющий перенос энер­ гии преимущественно к тимину, действительно существует.

10.3.Химические изменения в облученной ДНК

Вто время как исследования с помощью ЭПР, о которых речь шла выше, позволяют составить представление о парамаг­ нитной природе процессов, происходящих при облучении сухой

же положениях, обсуждение посвятим действию ионизирующего излучения. Однако все же вкратце коснемся изменений, вызван­ ных действием УФ-облучения, что поможет интерпретировать результаты, описанные в гл. 12 и 13. Но, к сожалению, это будет

детально обсуждаются в обзорных статьях Шоулса [45], Вайса

УФ-излучения на пиримидиновые основания поевящена обшир­ ная литература, тогда как по количественной фотохимии пуриновых оснований известно сравнительно небольшое число работ.

в 10 раз интенсивнее пуринов. Соответственно квантовый выход (т. е. число измененных молекул, деленное на число поглощен­ ных квантов) составляет около Ю - 3 и Ю - 4 соответственно. По­ этому считается, что с биологической точки зрения большее значение имеют изменения пиримидиновых, а не пуриновых ос­ нований.

Наряду с гидратацией 5,6-двойной связи пиримидинов, обра­ тимой при воздействии тепла или кислоты и поэтому, вероятно, менее значимой биологически, происходит димеризация сосед­ них пиримидиновых оснований, которая считается самым суще-

151

ственным из повреждении, индуцируемых УФ-облучением.

остатками пирнмидииов [3]. Из димеров чаще всего образуется димер тимина, для которого возможны шесть изомеров. До сих. пор в облученных олигонуклеотидах обнаружено пять из этих

шихся димеров [49, 53]. Скорость образования димеров макси­

способно расщеплять уже образовавшиеся димеры. Эти данные находятся в согласии с биологическими наблюдениями, свиде­

из летальных повреждений, индуцированных УФ-облучением, в этом процессе участвуют также димеры других пиримидинов и другие повреждения.

Ионизирующее излучение. Распад свободных оснований, об­ лученных в водных растворах, можно определить по уменьше­ нию оптического поглощения в УФ-части спектра или с по­ мощью бумажной хроматографии, а также по специфическим

на 5,6-двойную связь. В аэробных условиях это приводит к об­ разованию пиримидин-окси-оксиперекиси, а в анаэробных условиях при действии двух ОН-радикалов —к образованию гли­ коля. Окси-гидроперекиси урацила и цитозина неустойчивы и при взаимодействии образуют соответственно гликоль и изобарбитуровую кислоту. Подробное описание этой реакции и ее про­ межуточных ступеней можно найти у Латарже [33]. В отличие от случаев с УФ-излучением при ионизирующем облучении за­ мороженных растворов тимина димеры не образуются [54].

Радиационнохимические изменения пуринов не были так подробно изучены. В анаэробных условиях разрушается глав* ным образом имидазольное кольцо, в то время как в присутст­ вии кислорода наблюдается пероксидация 5,6-двойной связи. Образующуюся в результате этого процесса оксигидроперекись так и не удалось выделить, очевидно, из-за ее нестойкости.

152

Были также обнаружены циклонуклеотиды [31J, которые, воз­

клеозид>нуклеотид>ДНК. В предыдущем разделе было пока­

Значения G для распада или высвобождения шуриновых

ипиримидиновых оснований при облучении ДНК

вводном растворе

"0,5% -ная концентрация, электроны 15 Мэо, азот [25] .

дельных оснований в облученном растворе ДНК. Как видно из таблицы, в присутствии кислорода разрушается в два раза больше оснований, чем в анаэробных условиях, а распад тимина

врежденных оснований происходит главным образом в резуль­ тате действия химических веществ на дезоксирибозную группу и молекулы ДНК, и вызывается, по всей вероятности, гидролизом N-глнкозидной связи [47]. В анаэробных условиях восстанавли­ вающие радикалы воды, по-видимому, атакуют остаток дезок-

153

бозы с помощью реакции (6.7) G будет равно 0,4. Этот косвен­ ный вывод подтверждается данными о том, что при облучении эквимолярных растворов четырех нуклеотидов остатки основа­

водного компонента ведет к разрыву нуклеотидной цепи. При этом высвобождаются 3'- и б'-монофосфаты либо прямо, либо как следствие повреждения дезокснрибозы, образующей непроч­ ный промежуточный диэфнр, что в конечном счете приводит к потере поврежденного остатка дезокснрибозы. Вторая атака в радикале воды может превратить эту моноэфирную группу в

фосфомоноэстеразы. После достаточно продолжительной инку­ бации этот фермент отщепляет неорганический фосфат от всех конечных моноэфирных групп, что впоследствии можно изме­ рить фотометрически. В то же время этот метод дает возмож­ ность определить число индуцированных облучений одноцепочечных разрывов. Значение G для разрыва одной из полинуклеотидных цепей при аэробном облучении составляют 0,4 и 0,8

были обнаружены многочисленные конечные продукты состав­ ных частей ДНК, поврежденных излучением (гидроперекиси, перекись водорода, аммиак и др.). Поскольку мы ничего не можем сказать о механизмах образования этих веществ, мы их не рассматриваем.

10.4. Разрывы полинуклеотидных' цепей

Изменения макромолекулярной структуры ДНК, как пра­ вило, определяют по изменению ее молекулярного веса. На рас­ пределение молекулярных весов непосредственное влияние ока­ зывают двухцепочечные разрывы и поперечные сшивки между двумя молекулами. Одноцепочечные разрывы, выявляемые фер­ ментативным способом, влияют на распределение молекулярных

тить ренатурацию. При этом трудно избежать образования во­ дородных связей в пределах клубка одиночной цепи.

154

Для определения молекулярного веса макромолекул обычно используют весьма разнообразные методы, такие, как измерение светорассеяния, осмоса, вязкости и седиментации. С помощью этих методов сопоставимые результаты получают только в слу­ чае, если объект содержит молекулы с достаточно однородным распределением молекулярных весов. Однако до сих пор боль­ шинство исследованных проб ДН К состояли из фрагментов с различными молекулярными весами, что является следствием процедуры, используемой для выделения ДНК. Такого рода распределение можно характеризовать двумя средними величи­ нами: среднечисленным молекулярным весом

и средневесовым молекулярным весом

где tii — число молекул с молекулярным весом М{. Для случай­ ного распределения молекулярных размеров (применимых ко многим препаратам ДНК) справедливо отношение

цах получают средние величины, зависящие от способа измере­ ния. Большая часть применяемых способов дает результат, ле­ жащий между Мп и Ми: Осмотические способы измерения дают среднечисленный молекулярный вес М,х. Однако эта длительная

диобиологических опытах. Средневесовой молекулярный вес Mw определяется при измерении светорассеяния, в то время как из­

тической центрифуги, экстраполируется к нулевой концентрации

ченных молекул может изменяться, обычно рассчитывается не число разрывов иа молекулу, а их частота. Одноцепочечные раз­ рывы часто выражаются в расчете на нуклеотид (Bi), а двухцепочечные разрывы — на пару нуклеотидов (Во). В следующем разделе мы будем пользоваться этими обозначениями.

Облучение сухой ДНК в вакууме вызывает одно- и двухцепочечные разрывы, частота которых линейно возрастает с до­ зой (рис. 73). Значение G, рассчитанное на этих кривых, равно

155

чаще, чем двухцепочечные. Если облучение проводится в атмос­

потери энергии, а не случайным совпадением двух соседних оди­

против, имеет иную кинетику. Как молено видеть из рис. 74, их частота возрастает пропорционально квадрату дозы. Такой же результат получают при измерении вязкости (8]. Эта зависимость показывает, что при действии радикалов воды два тяжа не мо­ гут разрываться одновременно, что вполне естественно. Раз­ рыв двойной спирали происходит только в случае, если два оди­ ночных разрыва точно или приблизительно противостоят друг

156

Другу. В последнем случае для обнаружения двойного разрыва необходимо раскрытие водородных связей на участке между двумя разрывами.

где (п—1)/2 — максимальное число пар нуклеотидов между двумя двухцепочечными раз­ рывами, вызывающими двой­ ной разрыв, и р — число одноцепочечных разрывов до облу­ чения. В необлученных про­ бах р обычно настолько мало (например, Ю - 4 [20]), что им можно пренебречь при высоки ; дозах. Кривая на рис. 74 по­ строена по точкам с помощью уравнения (10.5) при п = 7. Это свидетельствует о том, что двухцепочечный разрыв проис­ ходит в том случае, если в при­ сутствии одноцепочечного раз­ рыва па одном тяже следую­ щий разрыв в- комплементар­ ной цепи локализован точно напротив первого или же на расстоянии, не большем, чем три нуклеотидных пары.

чество энергии требуется для одноцепочечного разрыва в сухом состоянии и растворе. Поскольку количество двойных разрывов в растворе возрастает пропорционально квадрату дозы, значе­ ния G в общепринятом смысле слова определить нельзя. Перво­ начально образуются лишь одноцепочечные разрывы, но с уве­ личением дозы доля двойных разрывов постепенно возрастает. Поэтому можно было бы ожидать, что в водной системе, если

157

J 58

образуются развернутые мономеры (см. разд. 9.5). Эти данные также показывают, что образование поперечных сшивок облу­ ченной Д Н К происходит при участии свободных радикалов, спо­ собных при взаимодействии с кислородом превращаться в пе-

и концентрацию макромолекул, ионную силу растворителя, по­ лярные эффекты и т. д. Результаты опытов с синтетическими макромолекулами (ср. [26]) показали, что имеется оптимальная концентрация для образования поперечных сшивок. При более высоких концентрациях скорость их образования на единицу дозы уменьшается, постепенно приближаясь к величине, полу­ ченной при облучении в сухом состоянии. При уменьшении кон­ центрации частота возникновения поперечных сшивок сни­ жается до тех пор, пока они совсем не исчезают при концент­ рации ниже критической. По мере увеличения молекулярного веса облученной молекулы критическая концентрация сни­ жается. Если облучение проводится в диапазоне промежуточ­ ных концентраций, поперечные сшивки возникают с самого на­ чала, но с возрастанием дозы деградация может уменьшить молекулярный вес фрагментов и тем самым поднять критиче­ скую концентрацию выше уровня концентрации фрагмен­ тов ДНК. Следовательно, в этих условиях образование попе­ речных сшивок не наблюдается даже после действия высоких

Д'ОЗ.

К сожалению, скорость образования поперечных сшивок ДНК, облученной в водном растворе, до сих пор не исследова­ лась как функция различных параметров. Можно только от­ метить, что облучение вызывает появление поперечных сшивок у молекул также и в растворе. Кокерель и др. [7] облучали растворы Д Н К бактериофага Т1 (концентрация 0,2 мг/мл) и определяли распределение молекулярных весов, измеряя вяз­

пендикуляр 1 на рис. 76). Это указывает на однородность пре­ паратов ДНК, которая достигается при очень тщательном вы­

материала имеют более низкий молекулярный вес, чем необлученная ДНК, и примерно 30%, благодаря поперечным сшив-

159