книги из ГПНТБ / Шамин А.Н. Развитие химии аминокислот

метрического синтеза аминокислот, чем сразу перевёл Хп- мшо аминокислот иа новую ступень. В этих открывающих белковый цикл исследованиях Э. Фишер, как и во многих предыдущих работах, проявил свою способность модифи­ цировать и использовать для разрешения возникающих проблем самые различные методы.

В основе способа разделения оптических антиподов ле­ жало образование комплексов с оптически активным алка­ лоидом. Фишер заметил, что аминокислота реагирует с алкалоидом гораздо успешнее, если аминогруппа заблоки­ рована. Для этого, используя модифицированный метод беизошшрованпя, он получал N-бензоилпроизводные ра­ цемических аминокислот. Кстати говоря, создание метода бензоплировання аминокислот имело, вероятно, не мень­ шее значение для дальнейшего развития химии аминокис­ лот, чем метод разделения стереоизомеров. Фишер сумел пробензоилировать аспарагиновую и глутаминовую кисло­ ты, что прежде не удавалось сделать.

К полученным N-ацилпроизводным добавляли алкало­ ид, например, бруцин, стрихнин, хинин, хинпдни пли цин­ хонин. Образовавшиеся две диастереопзомерные формы солей обладали различной растворимостью. После разделе­ ния этпх диастереоизомеров акалоид отделяли и ацильную группу удаляли путем гидролиза.

Этим методом были расщеплены N-ацилпроизводпые (бензоилпроизводные) рацематов аланина, аспарагиновой и глутаминовой кислот [10], лейцина [11], фенилаланина [12], тирозина [13]. В дальнейшем кроме бензоилированных Э. Фишер использовал и другие N-ацилпроизводиые. В работе, проведенной совместно с О. Варбургом, для полу­ чения изомеров лейцина он предложил использовать формилпроизводные [14]. При разделении стереоизомеров серина [15] и пролина [16] были использованы N-(ju-hh- тробеизпл) производные аминокислот, так как эти соеди­ нения лучше растворялись в воде.

Э. Фишер понимал, что дальнейшее развитие работ на этом этапе зависит в первую очередь от знания строения и свойств отдельных аминокислот. Но в то время не суще­ ствовало разработанного и широко применимого общего метода синтеза а-аминокислот. Используемые для синтеза аминокислот реакции замещения соответствующих галогенизированиых жирных кислот и циангидринный метод А. Штреккера оказались не столь универсальны, как это

72

тогда считалось. Дело в том, что для их успешного исполь­ зования необходимо было иметь либо соответствующие а-галогеппроизводные жирных кислот, либо соответствую­ щие альдегиды, получение которых оказалось весьма тру­ доемким, а иногда и просто невозможным в то время де­ лом.

При создании общего пути синтеза а-аминокпслот Э. Фишер снова проявил себя мастером использования из­ вестных методов для решения конкретных задач. Для про­ ведения синтеза он брал арилироваииую или алкилирован­ ную им малоновую кислоту, которая легко бромировалась в a -положении. При этом происходило декарбоксплирование и образование а-бромкарбоиовой кислоты. Таким спо­ собом ему удалось получить из бензилмалоповой кислоты фенилаланин [17], а из изобутилмалоиовой кислоты — лей­

цин [18].

Вг» СО,

(СНз)аСНСНзСН(СООН)3-» (СН.ч)2СНСНзС—Вг (СООИ)з----->

NH,

-> (СТ-Ь)зСНСНоСНВгСООН— >(CHs)aCHCHsCHNHsCOOH.

Однако перед Фишером возникла новая задача, которая требовала совершенно иных подходов для своего реше­ ния — синтез диаминокислот.

Описанный выше путь был для этого непригоден. Полу­ чаемые с большим трудом и малым выходом дважды бромированные производные при обработке аммиаком пере­ ходили в циклические продукты. Эти побочные реакции в 1900 г. не смог обойти и такой талантлпвый эксперимен­ татор, как Р. Вплыптеттер, который не сумел синтезиро­ вать а, 6-дпбромвалерпановую кислоту [19]. Но Э. Фишер, используя малоновую кислоту, сумел преодолеть этп труд­ ности. Синтез он проводил по схеме: ('у-фталпмидопропил)- малоновый эфир бромировали в a -положении, омылялп (происходило декарбоксилпроваипе), аминировали и уда­ ляли фталильпую защитную группу нагреванием в НС1:

• СоШ 44N (СНз)з СВг(СООН)о

V '

73

со

Этим методом Эмиль Фишер синтезировал орпптип [20]. Метод получения аргпппна из природного орпптипа был ра­ нее разработан Э. Шульце и Э. Впнтерштейном [21].

Затем Э. Фптпер совместно с Ф. Вейгертом разработали оригинальный метод синтеза очень важной аминокисло­ ты — лпзппа. Для этого давно известный (^-цпаиопроппл)- малоновый эфпр переводплп действием азотистой кислоты в оксим эфира валериановой кислоты, который восстанавли­ вался металлическим натрием и спиртом с последующим омылением [22]:

NCCH2CM2CII2 (СООП)з NCCM2CH2CI-I2C (NOI-I) COOR — > -> NH2CH2CI-I2CH2CII2CHNH2COOII.

После того как в 1865 г. Э. Крамер среди продуктов гидролиза белков шелка открыл серии [23], эта аминокис­ лота из-за наличия в пей окспгруппы стала, пожалуй, од­ ной из самых пптереспых аминокислот для химиков, иссле­ довавших белок. Строение этого соединения в точности не было известно в то время, когда Э. Фишер пытался его синтезировать. Ему совместно с Г. Лейксом очень быстро удалось получить серии из гликолевого альдегида [24]:

а затем Г. Лейке усовершенствовал этот метод [25]:

т.трм ТТТСГ

С2Н5 ОСН2СНО _ - . C 2H5OGI-I2CHNH2CN — С2ITлОСН2С1-INн2сООН----.

NHa

-з h o ch 2ci-in h 2c o o h .

Врезультате этих синтезов была окончательно установлена структура сернпа как а-амнпо-р-океппропиоповой кислоты.

Эти работы помогли Фишеру показать, что L-серпи явля­ ется важным компонентом продуктов распада фиброина шелка [26],

74

В целом этими работами было подготовлено важное за­ ключение о том, что многие аминокислоты, встречающиеся в белковых гидролизатах, оптически активны, обладают амипогругшой в а-положешш, причем имеют общую L-копфигурацпю у а-углеродного атома.

Первое свидетельство в пользу этого утверждения было получено в 1907 г. Э. Фишером и К. Раске [27, 28]. Они осуществили взаимопревращения трех аминокислот и пре­ вращение их в идентичные продукты. При этом они исполь­ зовали реакции, не затрагивающие асимметрический а-уг- леродный атом. Полученный Фишером L-серии они пере­ вели в L-алаппп и L-цистпм через хлорированный продукт:

г

1

ш-ь

I

СНз-С—соон

I

н

Э; Фишер придавал этим работам большое зиачеипе. Он допускал, что подобными превращениями оптически активных соединений биосинтез аминокислот в организме может быть связан через глицериновую кпслоту с угле­ водородным обменом.

В работах Фишера заложены основы изучения кор­ реляции конфигураций стереоизомеров «.-аминокислот.

Создание Эмилем Фишером новых разнообразных ме­ тодов синтеза аминокислот имело важные методологические последствия. Они имели принципиальное значение для дальнейшего развития как синтетической химии амино­ кислот, так и стереохимии аминокислот, подлинным ос­ нователем которой является Э. Фишер.

Прежде всего, работы Э. Фишера показали, что пути к конструктивному зиаишо принципов строения амино­ кислот, их получения, а также основных свойств лежат не в направлении создания достаточно общих методов, подобных методам А. Штреккера и Г. Лпмпрпхта (см. [29]). Оказалось, что и получение алапппа А. Штреккером в 1850 г. и синтез лейцина Г. Лнмпрпхтом в 1870 г.

75

вавших химиков. И хотя модификации метода Штреккера

серина Э. Фишером, по существу, работы последнего уста­ новили водораздел между х и м и е й а м и н о к и с л о т в ц е л о м и х и м и е й п р и р о д н ы х а м и н о к и с л о т . И еслп в химии аминокислот в целом метод Штреккера сохранил важные позиции, н его история, включающая разработки многочисленных модификаций и усовершен­ ствований от А. Пиинера и А. Шпплкера в 1889 г. [31] до Н. Д. Зелинского п Г. Стадникова в 1906 г. [32], вхо­ дит важным звеном в историю органического синтеза, то в химии природных аминокислот он остался групповым методом, имеющим локальное значение.

Такая же судьба постигла и другие методы, которые первоначально рассматривались как общие: ампнпрованпе а-галогенаминокислот, впервые использованное А. Кауром в 1858 г. (см. [32]), ампнированне с молеку­ лярной перегруппировкой, введенное в 1890 г. Т. Курциусом и В. Зибером [33], и некоторые другие, в том числе разработанные Э. Фишером и сначала рассматриваемые как общие.

Граница между химией природных аминокислот п аминокислот в целом была установлена работами Эмиля Фишера и еще в одной области — в стереохимии амино­ кислот, объединенной им в единое целое из разрозненных наблюдении.

Именно синтетические работы Э. Фишера и последо­ вавшие за ними эксперименты по взаимному превраще­ нию отдельных аминокислот привели к созданию пред­ ставления об обязательности а-амиио-строения природ­ ных аминокислот. Этот вывод при его достаточном экспе­ риментальном подтверждении значил очень много. Вопервых, этим утверждался принцип единой пептидной связи аминокислот в белках. Во-вторых, встал вопрос о создании сложной системы гомологического, а также пер­ вичных и вторичных генетических рядов аминокислот,

вкоторых природные аминокислоты могли быть отнесены

кгомологическому а-амипо-ряду, но ^-радикальному ге­ нетическому ряду. Вместе с тем работы по §-, у-амино-

кислотам и т. д., включая важные работы отечественных ученых — В. М. Родионова [34], В. С. Гулевича и его уче­ ников [35], Н. Д. Зелинского [36],— оказались не вклю­ ченными в химию природных аминокислот белкового происхождения.

Э. Фшпер для обозначения всех детален превращений и строения оптически активных изомеров аминокислот разработал терминологию, которой до сих пор широко пользуются химики и которая повлияла иа многочислен­ ные, разработанные позднее новые классификации.

Начатые Э. Фишером работы по доказательству //-кон­ фигурации а-углеродиого атома природных аминокислот составили важную фазу развития стереохимии амино­ кислот.

Создание аналитической химии аминокислот

Накопление данных о строении встречающихся в белко­ вых гидролизатах аминокислот и их свойствах позволило Э. Фишеру перейти к разработке методов препаративного выделения аминокислот из белковых гидролизатов.

Тенденция физиологов и биохимиков исследовать продукты начального неполного расщепления белковых веществ приводила к столь противоречивым результа­ там, что ни о какой их систематизации не могло быть и речи. Получаемые при таком гидролизе смеси высокомо­ лекулярных осколков (кстати, в то время и не предпола­ гали, каков истинный молекулярный вес даже этих фраг­ ментов, не говоря уже о целой белковой молекуле) были настолько неоднородны, что попытки разделить их н тем более изучать количественно не могли увенчаться успе­ хом. Э. Фишер в соответствии со своими концепциями о построении белков из низкомолекулярных веществ, како­ выми были аминокислоты, полагал, что имеет смысл осуществить только полный гидролиз белков, но не столь глубокий, чтобы конечные продукты распада могли пре­ терпевать какие-либо существенные изменения. Эти ра­ боты послужили основой многолетних исследований ус­ ловий протекания гидролиза белковых веществ, который позволял бы наиболее объективно судить о существова­ нии тех или иных структур в составе молекул. Данные, свидетельствующие о том, что по крайней мере некото­ рые аминокислоты включаются в состав белков в онти-

77

чески активном состоянии, позволили попользовать со­ хранение оптически активных конечных продуктов в ка­ честве критерия «осторожности» гидролиза.

Первые методы определения аминокислот в гидроли­ зате сводились к методам их осторожного последователь­ ного препаративного разделения с последующим весо­ вым определением состава фракции, почти всегда видо­ измененных. Так, как разделить аминокислоты на осповаипп их различны! способности к кристаллизации не удавалось, Э. Фишер решил прибегнуть к фракцпонироваииой перегонке их эфиров. Т. Курцпус ранее пока­ зал, что эфиры аминокислот (по крайней мере глицина) не разлагаются при нагревании в вакууме. Э. Фишер об­ наружил, что этиловые эфиры многих аминокислот (моноамнпомонокарбоновых и мопоампнодпкарбоновых) мо­ гут перегоняться в вакууме без разложения. Главная трудность заключалась в разработке общего метода по­ лучения свободных эфиров аминокислот, находящихся в смеси.

Первый шаг в количественном анализе аминокислот сделали в 1900 г. А. Коссель и Ф. Кутчер, разработавшие метод выделения из гидролизатов аргинина, гистидина и лизина в чистом виде с последующим их весовым опре­ делением [37]. Метод был основан па образовании нера­ створимых солеи серебра аргинином и гистидином. Остающийся в растворе лизни мог быть количественно осажден фосфорцовольфрамовой кислотой. Серебряные соли гистидина и аргинина излагали сероводородом, тем самым аминокислоты переводили в раствор. После этого проводили дробное осаждение обеих аминокислот в виде серебряных солей: в нейтральной среде выпадала соль гистидина, а при подщелачивании — соль аргинина.

Использование хлоргидратов эфиров аминокислот по методу Т. Курциуса казалось совершенно невозможным из-за неудобств, связанных с дальнейшим переосаждеиием солей точным количеством серебра. Но Э. Фишер на­ шел очень простое, как кажется теперь, решение вопро­ са. Полученные по методу Курциуса хлоргидраты зефи­ ров аминокислот он переводил в свободные эфиры, обра­ батывая их концентрированной щелочью на холоду. Эфиры при этом заметно не омылялись [38]. Этот про­ стой и изящный прием позволил Э. Фишеру легко этерифицировать смеси продуктов гидролиза белковых моле-

78

кул. Соперник Э. Фишера Т. Курциус назвал эту рабо­

а м и н о к и с л о т в п е р в ы е о т к р ы в а л а п у т ь к

ры всех известных в то время природных п близких им аминокислот и исследовал их свойства. Он установил, что при этерификации не происходит значительной ра­ цемизации оптически активных аминокислот. Фишер определил условия перегонки отдельных эфиров, пока­ зав, что они перегоняются в вакууме без значительного разложения и эта процедура может быть использована для количественных анализов.

После проведения предварительных исследований Э. Фишер приступил к анализу белковых гидролизатов. Первое применение «эфирного метода» было осуществле­ но нм в 1901 г. при анализе казеина [40].

Препаративно-аналитический метод Э. Фишера был первым в ряду разработанных в следующие годы мето­ дов определения тем нли иным образом модифицирован­ ных аминокислот. Надо сразу же отметить, что ип один пз созданных позднее методов, вплоть до разработки хроматографических методов, не смог соперничать с ме­ тодом Фпгпера по одной единственной причине: он по­ зволял определять практически все аминокислоты, в то время как все остальные методы продолжали оставать­ ся групповыми. Этот метод не смогли заменить пли вы­ теснить вновь разрабатываемые методы качественного и количественного определения отдельных аминокислот, так как ни разу не удалось создать удовлетворительную их комбинацию для полного аминокислотного анализа. Среди последних наиболее исторически важными были эмпирически найденные цветные реакции для определе­ ния отдельных аминокислот. Некоторые пз этих реакций оставались долгое время важными пробами на белок. Их пытались также использовать для колометрпческих опре­ делений аминокислот, и в 10—30-х годах в этом направ­ лении были достигнуты существенные успехи.

Одиако попытки аналпза аминокислот в биологиче­ ском материале не приносили успеха из-за невозможно­ сти раздельного определения аминокислот в смеси в том

79

пли ином препарате, будь то гидролизат плп вытяжка пз тканей. К числу таких реакций относилась так называе­

Другой давно используемой реакцией была «ксаптопротепновая реакция» Г. Мульдера па аминокислоты, со­ держащие бензольные ядра; кроме нее широко распрост­

но, ппигидрлповоп пробе, разработанной в деталях Э. Абдергальдепом (1911 г.) [47] и не специфической для аминокислот. Реакция О. Фолина на тирозин, подвергаясь многочисленным модификациям, стала одной пз первых, широко применяемых в прикладной биохимии реакций па белки. Нипгпдриновую пробу вновь начали широко исполь­ зовать после создания распределительной хроматографии на бумаге как средство проявления ампиокпслотпых пя­ тен. Но использование этих реакций относилось уже к сле­ дующему периоду развития химии аминокислот.

С изучением качественных цветных реакций в XIX в. наиболее тесно связано исследование трппофана, цветные реакции па который, зависящие от присутствия пндолыюй группировки, были известны гораздо раньше его открытия. Дще Тпдемап и Гмелни в 30-х годах XIX в. заметили, что хлор окрашивает экстракт панкреатического сока в розовокрасный цвет. Позднее в 50-х годах ХТХ в. К. Бернар, а еще позже В. Krone описали получение цветной реакции с хлорной и бромной водой при воздействии их па разлпчпые вытяжки [ 48, 49]. На связь этпх реакций с присутствием индольпой группировки в исследуемых вытяжках указы­ вал М. Ненцкий [50]. В конце ХТХ в. исследователи, в пер­ вую очередь изучавшие протсозтл и пептоны, для чего ши­ роко использовались цветные реакции, стали давать наиме­ нования этим соединениям и пытаться представить себе этот неизвестный хромоген. Так, Р. Неймейстер писал: «Вещество, непосредственно входящее в состав продуктов пищеварения и дающее фиолетовую окраску с хлор- и бромсоедииенпями, предлагаю назвать протепнхромогеном» [51]. Против этого наименования [52] были возраже-

80

ния, ио факт его введения знаменателен как начало интен­ сивных попыток идентификации хромогена. Его приро­ дой интересовался М. Неицкпй [53], его пытался выделить К. Бейтлер [54], наконец, Д. Кураев [55] вплотную подо­ шел к выделению повой аминокислоты, полулпв, по всей вероятности, как считал Ф. Гопкгатс, монобромпроизводное триптофана.

Упомянутая выше реакция А. Адамкевича также ока­ залась реакцией на триптофан. Однако доказательство того, что это именно так, было получено Ф. Гопкинсом и С. Коулом в 1901 г. после выделения ими триптофана из гидролизата казеина [56] и доказательства его аминоки­ слотной природы. При этом они показали, что течение реакции Адамкевича зависит от присутствия примесей глпоксалевой кислоты в использованной Адамкевичем для проб уксусной кислоте. Гопкинс и Коул показали также, что после того, как происходит достаточно глубокий гидролиз белковых веществ, гидролизат дает реакцию Адамкевича. На этом основании они сделали вывод, что хромоген представляет собой достаточно просто устроен­ ное вещество, а также отметили, что иа интенсивность цветной реакции влияет характер гидролиза — наиболее удобным бьтл ферментативный (триптический) гидролиз. Гопкппс и Коул обнаружили, что окрашиваемое вещество может быть осаждено препаратами ртути, при этом в оса­ док вместе с иим выпадал только легко отделяемый ци­ стин. Очистка нового препарата после этого была доста­ точно тривиальной.

Английские химики • определили элементный состав триптофана и предположили, что он является производ­ ным скатола. Но Эллиигер после предварительных теоре­

а-амино-[3-3-индолпропионовой кислоты [57].

С выделением триптофана и установлением его строе­ ния была решена задача нескольких цветных реакций на белки и показана их аминокислотная природа. Реакцию Адамкевича стали рассматривать как качественную цвет­ ную реакцию на триптофан.

Таким образом, в' первой четверти XX в. наиболее пло­ дотворным для развития химии белка оставался эфирный метод Э. Фишера — вершина аналитической химии амино­ кислот того времени.

81