книги из ГПНТБ / Шамин А.Н. Развитие химии аминокислот

биологической Мекке конца XIX в. Он заметил, что у не­ которых мелких кораллов скелет состоит из роговидной массы. Предположив, что эта масса является белковым веществом, он подверг ее гидролизу соляной кислотой. В процессе гидролиза происходило выделение значитель­ ных количеств паров пода. Изучаемое вещество, действи­ тельно, оказалось белком. Дрексель выделил из его гид­ ролизата лейцин, тирозин и лизни и обратил внимание иа нестойкое вещество, содержащее иод. Этого вещества в белке должно было быть очень много, так как сухой белок содержал 7,89% иода, а поскольку содержание иода было

гидролизу в присутствии баритовой воды, рассчитывая, что образуется йодат пли перйодат бария. Но этого не произо­ шло. Когда из гидролизата был удалей барий, а раствор обработали нитратом серебра, выпал густой хлопьевидный осадок поднда серебра. Очистка органического иодсодержащего соединения привела к получению кристалли­ ческого вещества. Свойства его и ближайших производ­ ных были подробно изучепы. Был определен его элемент­ ный состав, который приблизительно соответствовал формуле CiHsNJO:, как впоследствии оказалось, неверной.

Таким образом было выделено первое иодсодержащее органическое соединение животного происхождения. Дрексель считал, что это вещество — продукт гидролиза белка, но полагал, что оно достаточно сложно по строе­ нию. Однако между исходным белком и полученным веще­ ством было одно интересное различие: иод в белке был не­ стабилен при воздействии соляной кислоты, новое же ве­ щество было устойчиво.

Дрексель еще до опубликования результатов сообщил методику выделения подогоргоевой кислоты, как он на­ звал новое соединение, Ф. Хундесхагену. Последний занял­ ся изучением содержания иода в белках и нашел ряд бел­ ков, где содержание иода достигало нескольких процентов. [63]. Хотя он и не смог выделить иодсодержащие орга­ нические соединения, но сделал много важных наблюде­ ний над способностью их давать цветные реакции.

На основании наблюдений Хундесхагеиа Дрексель смог определить природу выделенного им соединения. Хотя это определение носило предположительный харак-

52

тер, Дрексель не ошибся. Он писал: «Содержащие сереб­ ро растворы дают с реактивом Миллона красное окрашива­ ние, возможно, они являются иодсодержащими органиче­ скими соединениями — иодтпрозипом и веществом иодспонгином» [62]. Сам Хундесхаген придерживался оши­ бочного представления о строении иодсодержащего соеди­ нения, считая его не аминокислотным производным. .

Эти открытия укрепили позиции сторонников представ­ ления о преобладающей роли аминокислот в построении молекулы белка. Они показали также, что в молекулу белка, могут входить остатки разнообразных аминокис­ лот, некоторые из которых имеют четко выраженные ос­ новные свойства, отражающиеся на свойствах белков. Вы­ ше мы видели, что открытие новых аминокислот все ча­

либо других источников, за этим сразу следовали направ­ ленные поиски этой аминокислоты в белковом гидролиза­ те и открытие ее уже в составе белков. Так было, напри­ мер, в случае фенилаланина и аргинина. Однако остава­ лась одна аминокислота, открытие которой в белковых ве­ ществах должно было значительно повлиять на представ­ ления о свойствах и строении последних. Это была един­ ственная известная серусодержащая кислота — цистин. Почти столетие прошло с момента ее открытия, но в бел­ ках она обнаружена еще не была.

Несмотря на то, что в 1865 г. Э. Крамер в своей работе проводил аналогию между серином, аланином и цистином, а о наличии серы в белках говорили еще в начале века, только в 1884 г. Э. Кюльц заинтересовался присутствием серы в белках и вопросом, связана ли она с цистином [64]. Продолжая начатые исследования форм существования се­ ры в белках, он поручил изучение вопроса о соотношении содержания серы и содержания цистина в белках своему племяннику и ассистенту Рихарду Кюльцу. Но Р. Кюльц через год умер и его работа осталась неоконченной, а ре­ зультаты первых экспериментов не увидели света вплоть до 1890 г., когда Э. Кюльц опубликовал их [65].

Э. Кюльц и Р. Кюльц обнаружили, что при действии на фибрин растертых тканей поджелудочной железы в при­ сутствии салициловой кислоты в течение двух суток не происходило выделение сероводорода. Из полученного гид­ ролизата Кюльц выделил характерные шестигранные

53

кристаллы цистина. Однако он воздержался от утвержде­ ния, что выделенный цистин происходит из белка. Он до­ пускал его предсуществование в свободной форме в ткани поджелудочной железы или полагал его продуктом жиз­ недеятельности микроорганизмов.

Оценивая исторически эту работу, имеет смысл ска­ зать несколько слов, объясняющих потери цистина при изучении белковых гидролизатов1. До Глазиветца и Габермана для гидролиза белков использовали серную кислоту (метод Мульдера с использованием щелочи получил мень­ шее распространение). При этом цистин всегда увлекался в осадок сульфатом кальция в процессе нейтрализации из­ бытка кислоты. Даже использование HG1 не сразу приве­ ло к успеху, так как при добавлении хлорида олова цис­ тин разлагался, а нрп добавлении HCL (для предотвраще­ ния образования гумииов — это был весьма распространен­ ный прием) переходил, как впоследствии выяснилось, в ци­ стеин, значительно более растворимое соединение 4.5

В 1894 г. А. Эммерлииг при гидролизе роговой ткани со­ ляной кислотой обнаружил в гидролизате смесь цистина и тирозина [67], но ие довел до конца их идентификацию. В 1895 г. Ф. Зутер, по поручению Баумана, попытался до­ казать переход цистина в цистеин в процессе гидролиза и очистки гидролизата [68]. Но он получил от Баумана фильтраты гидролизата роговой ткани, приготовленные за несколько месяцев до этого. Цистин в них был, естест­ венно, практически целиком потеряй.

Однако хорошо спланированные эксперименты Зутера сыграли определенную роль в истории структурной химии цистина, о чем речь пойдет ниже.

Успеха добился К. Мёрнер лишь в 1899 г. Ему удалось выделить цистин из солянокпслотпого гидролизата роговой ткани [69]. Гидролиз проводился им 15%-иой кислотой при температуре до 95° С в течение одной — двух педель. Гпд-

4В дальнейшем было показано, что чаще происходит процесс окпелепия цистеина, нормально присутствующего в белках, в цпстин.

Вдальнейшем проблема определения серусодержащпх амино­ кислот в нативных белках сводилась именно к блокированию этой реакции. Эволюция методов гидролиза белков от жестких ко все более мягким имела непосредственное влияние на оценку состояния —SII- н —S—S-групп в белках.

5Эту реакцию оппсал в 1884 г. Э. Бауман [66].

54

ролизат после механической о ч и с т к и нейтралпзовывалп, осадок вновь растворяли и обрабатывали окисыо свинца. Избыток свинца удаляли спиртом, осадок растворяли до­ бавлением щавелевой кислоты, раствор вновь нейтрализо­ вали СаСОл пли NH3 и после обработки избытком аммиака полученный фильтр использовали для кристаллизации. В результате выпадали кристаллы тирозина и цистина, ко­ торые можно было уже легко разделить [70]. Присутствие цистина в различных фракциях доказывалось также и цветными реакциями. Кристаллы были тщательно иденти­ фицированы и проанализированы. Выход был значителен и это тоже было одной из удач Мёрпера. Эта работа позво­ лила также получить многие достоверные сведения о свой­ ствах цистина, в частности, впервые установить существо­ вание двух стереоизомеров этой аминокислоты.

Таким образом, к 1900 г. из всех открытых аминокислот только валин еще не был найден в белковых гидролизатах, но и это открытие было не за горами.

Изучение строения аминокислот

В процессе разработки первых методов синтеза и изуче­ ния общих свойств аминокислот были сделаны первые за­ ключения об их конституции, а впоследствии и строении. Представление о гомологическом ряде аминокислот позво­ лило сделать несколько правильных заключений о взаимо­ отношениях сравнительно просто устроенных аминокис­ лот — глицина, аланина, лейцина.

В доструктуриую фазу изучения аминокислот было на­ коплено много данных не только о свойствах аминокпслот, но и о свойствах некоторых родственных им (или считаю­ щихся родственным) соединений. Работа по синтезу амииосоединений, начатая Вюрцем и Гофманом, была про­ должена во второй половине XIX в. Были разработаны многочисленные способы введения аминогруппы в различ­ ные органические соединения. О. Мендиус ввел метод образования аминогрупп действием водорода на нитрилы (1862 г.). М. Гербе достигал того же восстановлением во­ дородом амидогруппы (1899 г.).. А. Готье гидролизовал нитрилы в присутствии разбавленных кислот (1866 г.). Многочисленные частные реакции позволяли делать за­ ключения об углеродном скелете аминокислот. Значитель­ ные успехи были достигнуты в органической хпмнп али-

55

фатнческих п ароматических кислот. О том, какое значение имело это обстоятельство для развития знаний о структуре аминокислот, свидетельствует история синтеза аланина, о которой мы уже писали. Стремясь получить молочную кислоту, А. Штреккер, воздействуя на альдегпдаммиак цианистым водородом, получил аминонитрпл. Последний омылением переводился в аланин, а аланин действием азотистой кислоты (реакция, открытая Р. Пирпа) мог быть превращен в молочную кислоту. Таким образом, эти реакции вели к получению амиио- п соответствующих окспкпслот. Успехи в установлении строения последних вели

кустановлению строения соответствующих аминокислот.

Ворганической химии середины XIX в. (40—60-е годы) было синтезировано значительное число соединенпй. Их систематизация и характеристика дали обширный эмпи­ рия ескпй материал. Группа аминокислот могла заполнить

лишь одну ячейку в новой системе классификации органи­ ческих веществ. Вместе с тем некоторые их свойства, на­ пример, оптическая активность привлекалп к ним присталь­ ное внимание. Успехи синтеза, в частности после работ Штреккера, а также синтезы некоторых естественных аминопропзводных (таурпн — А. Штреккер, А. Кольбе, 1862 г.;

вия и расположения в них группировок, обусловливающих основные и кислотные свойства.

Эти знания позволили быстро перейти от описания вза­ иморасположения реакционных групп в простых аминокис­ лотах к полному описанию аминокислот в соответствии с принципами теории строения. В 1858 г. А. Каур сделал правильное заключение о строении глицина. Интересна последовательность его рассуждений. Он полагал, что так же как аминобензойная кислота образуется в результате восстановления нитробензойной кислоты, так и глицин дол­ жен образовываться при восстановлении нитроуксусной кислоты [71 ] 6.

6 Вершиной доструктурных представлений о строении аминокис­ лот и генетической связи между ними следует признать работу Крамера (см. Приложения, стр. 120). По существу, он сделал все необходимые выводы, которые впоследствии позволили построить структурные формулы не толькосерина, по н аланина и цисти­ на, причем гораздо более правильные, нежели следующие из данных синтеза аланина,

56

Но еще раньше в 1853 г. Л. Пастер провел важные со­ поставления свойств аспарагиновой кислоты и амидов не­ которых органических кислот [72]. Он доказал, что ампдп диамид яблочной кислоты, синтезированные им из эфира кислоты и аммиака, были изомерны аспарагиновой кислоте и аспарагину, но не идентичны им. Работы Пастера при­ влекли внимание к вопросу строения аспарагиновой кисло­ ты, но даже ее синтез, осуществленный в 1880 г. А. Дессенем [73] и в 1888 г. А. Энгелем [74], не позволил оконча­ тельно выяснить ее структуру. Однако в том же 1888 г. А. Пыоттн смог описать структуру аспарагиновой кислоты на основании ее синтеза [75]. К пониманию синтеза Пыотти и его правильному обоснованию вел достаточно длинный путь, в том числе через работы И. Гварески [76], полу­ чившего и изучившего ряд ураминовых производных.

Установление строения валина интересно тем, что при­ менение метода аналогии, успешно используемого при изу­ чении глицина и аланина, в данном случае было затрудне­ но. Эмпирическая формула валина C5HiiN0 2 приводила к нескольким вариантам аминосоединений: аминовалериа­ новой, амипоизовалериановой или этилметиламииоуксусной кислотам. Синтез аминовалериановой кислоты уже был описан Кауром в 1869 г.— обработка бромвалериановой кислоты аммиаком [77]. Но Каур не описал свойств сво­ его продукта, поэтому всю работу необходимо было вести сначала.

В1866 г. Д. Кларк и Р. Фиттиг синтезировали аминовалериановую кислоту [78] обработкой бромвалериановой кислоты аммиаком при 100° С в течение суток. Но полу­ ченный ими продукт имел ииую точку плавления, чем ва­ лин Ф. Горуп-Безанца. Однако последний допускал, что синтетический продукт Кларка и Фиттига и его аминокис­ лота идентичны.

Вэтих работах в 1878 г. была обнаружена ошибка, когда Э. Шмидт и Р. Захтлебен установили, что синтези­ рованная ими аминоизовалериановая кислота идентична аминокислоте Горуп-Безанца [79]. Это было подтвержде­ но синтезами амипоизовалериановой кислоты А. Лпп-

пом [80].

Однако вопрос о строении валина был вновь поднят Липпом в 1882 г. [81]. Он рассуждал следующим образом: раз аминоизовалериановая кислота не является валином Горуп-Безанца, как это может следовать из несовпадения

57

некоторых свойств синтетического и природного продукта, значит этот продукт есть не что иное, как аминовалериа­ новая кислота. Синтезировав амииовалериановую кисло­ ту, он сравнил ее с продуктом Горуп-Безанца и с «бутэланином» П. Штотцеиберже. Лини с удивлением отметил, что свойства валина и амииовалериаиовой кислоты замет­ но расходятся. Попытка решить вопрос строения валина зашла в тупик. Основной причиной возникновения труд­ ностей было сопоставление н е п р е п а р а т о в , получен­

Заключения о строении аминокислот на основании пер­ вых попыток пх синтеза были в значительной мере случай­ ными. Основанные на некоторых, иногда недостаточно оп­ ределенных аналогиях, они часто затушевывали вопрос и уводили в сторону от правильного пути. Так было, напри­ мер, с установлением строения тирозина К. Шмидтом и О. Нассе [82], которые сопоставили тирозин с салицило­ вой кислотой.

Хотя еще в 1859 г. Г. Штеделер на основании экспери­ ментов по изучению ряда соединений тирозина с тяжелыми металлами, кислотами и щелочами и ряда его моно- и ди­ нитросоединений, а также на основании возможности пре­ вращения тирозина в хлораиил наметил путь изучения строения тирозина [83], Шмидт и Нассе отвергли заклю­ чения Штеделера 7 на основании реакций окрашивания и чисто умозрительных аналогий с превращением глици­ на в уксусную кислоту. Знакомство с последним процес­ сом было явно недостаточно, чтобы делать заключения о строении такого вещества, как тирозин. Естественно, что попытки синтеза тирозина из галоидсалициловых кислот обработкой этиламином привели к веществам, которые невозможно было идентифицировать с тирозином. Струк­ тура этих веществ также оказалась неясной.

Положения Шмидта и Нассе были опровергнуты Л. Бартом [84]. Он предполагал, что тирозин — этиламино-

7 Штеделер подчеркивал, что тирозин принадлежит к ряду соеди­ нений типа глицина и лейцина. «Без сомнения,— писал он,— тирозин имеет такое же строение, как и эти вещества; соеди­ няется он не только с основаниями, но и с сильными кислотами по типу аммония» [83].

58

производное и-оксибензойпой кислоты. Однако на осно­ вании собственных экспериментальных данных Барту пришлось отказаться от этого утверждения. Оказалось, что амппо-га-оксибепзойная кислота, также как ампнобепзойная, амппосалицпловая и ампногпдрокоричная кисло­ ты, образует некристаллические продукты [85]. На оспованпи этих эмпирических наблюдений можно было судить о поведении аминогруппы в соединении, и Барт сделал сле­ дующее заключение о строении тирозина, оказавшееся пра­ вильным: «Кажется наиболее вероятным рассматривать тирозин как оксифениламипопроппоповуго кислоту» [85].

Однако решение об отнесении той или иной аминокис­ лоты к соответствующему, лишенному аминогруппы произ­ водному, еще не было ответом на вопрос о расположении отдельных атомов в молекуле аминокислоты. Здесь даль­ нейшее развитие представлений оказалось полностью за­ висящим от развития теории строения в целом.

Барт в своих работах уже руководствовался теорией строения. Но и использование представлений структурной химии для объяснения строения аминокислот ие всегда сра­ зу было успешным. Наиболее показательна в этом отноше­ нии история установления строения цистина. В ней наи­ более полно проявились слабые и сильные стороны методо­ логических подходов, основанных на теоретических пред­ ставлениях и па использовании эмпирических данных.

Впервые структурную формулу цистина попытались вы­ вести в 1871 г. Д. Дыоар и Э. Гемджи [86]. В основу своих построений они положили следующие экспериментальные данные: цистии после обработки азотистой кислотой мож­ но было перевести в соединение серебра, которое они приня­ ли за ппруват; нагревание цистина со щелочью при 150° С приводит к выделению аммиака и свободной серы; при дей­ ствии водорода образовывается сероводород. Для объясне­ ния этих превращений английские химики предложплп формулу CH2N H ,-C S-C O O H .

Через десять лет Бауман и Прёйсе [87], на основа­ нии наблюдений о выделении собаками бромфенплмеркаптаповой кислоты после введения бензола, предложили для нее формулу:

NHa

I

Br-CnHd-S-C-COOH

I

СНз

59

из которой была выведена формула цистина:

NH2

I

IIS—С—соон

I

СНз

Эта формула была подкреплена аналитическими данными (в отличие от формулы Дьюара и Гэмджи). Бауман и Прёйсе сомневались в правпльиости формулы англичан, так как цистин никогда не разлагался с образованием ме­ тиламина [87].

В 1884 г. Э. Кюльц снова вернулся к рассмотрению ана­ литических данных, неудовлетворенный приблизительно­ стью анализов Баумана п Прёйсе. Проведя тщательный анализ очищенных препаратов цистина, он сделал вывод:

«Анализ показал низкое содержание водорода для форму­ лы C3H7NSO2, но это содержание соответствовало формуле C3H6NS02, которая противоречит правилам. Верна ли она пли должна быть удвоена окончательно, может решить син­ тез цистина» [64].

Утверждение об удвоении формулы цистина вновь по­ ставило под сомнение уже выведенные структурные форму­ лы. Таким образом, если они сначала исходили не только из аналитических данных, но и из поведения вещества в ряде реакций, то возвращение к анализам опровергло каза­ лось бы обоснованные построения. Подобные исторические инверсии не редкость и характерны для самых разных фаз развития органической химии. Однако эти пиверсии не за­ кономерны, так как на примере изучения ряда аминокис­ лот, проведенного в эти же годы, мы видим, что тщатель­ ность проведения анализов и получение точных эмпири­ ческих формул снижает ошибки в использовании других данных, в том числе результатов синтеза при выведении структурных формул.

Примером использования данных по превращениям со­ единения для построения его структурной формулы может служить упоминаемая выше работа Зутера [68] и критика ее Бауманом [87]. Зутер обнаружил, что в процессе попы­ ток выделения цистина из гидролизата роговой ткани обра­ зовывалось промежуточное соединение, дающее голубое окрашивание с хлорным железом и фиолетовое с суль­ фатом меди. Эти реакции давала Р-тиомолочиая кислота SH—СН2—СН2—СООН, Бауман дал наблюдению Зутера

60

совершенно неожиданное толкование: он предположил, что тпомолочная кислота, этплсульфид, меркаптаповая кисло­ та, а также и цистин имеют общее исходное, содержащееся в белках,— тиоаспарагиновую кислоту:

SI-I

I

НООС—СНа—С—СООН

NHa

Виккери и Шмидт отметили, что «создание этой формулы явилось итогом изучения цистина в течение 85 лет» [58]. Но это утверждение не совсем верно. Уже в 1884 г. Баумап получил экспериментальное доказательство правильности эмпирической формулы цистина, предложенной Тауловым (CoHiaNaOiSa), а также утверждения Кюльца об удвоении формулы. Результатом этого было выведение двух фор­ мул (ие окончательных) для цистина и цистеина:

НООС—С—S—S—С—СООИ и НООС—C -SH

Эти формулы — более важный итог изучения цистина, нежели «тиоаспарагпновый» вариант Баумана. Именно их можно назвать итогом 75 лет изучения цистина 8.

Гораздо быстрее произошло установление строения феиплалаптша. Шульце и Барбперп, изучив свойства кристал­ лического препарата фенилаланппа, сразу же отметили не­ сколько принципиальных обстоятельств. Они установили формулу повой аминокислоты: CnHiiNO;, [46]. Ее окисле­ ние сопровождалось образованием, как отш полагали, аминобеизойпой кислоты; при сухой перегопке выделялся фепилэтплампп. Шульце и Барбперп сделали уверенный вы­ вод: «Наша аминокислота должна быть амипофенилпропионовой кислотой» [88]. Эта легкость установления принципа строения аминокислоты, гораздо более сложной, чем, на­ пример, лейцип, объяснялась успехами в изучении свойств ароматических соединений. Одиако факт открытия новой ароматической аминокислоты в гидролизате белка привел к появлению спекулятивных предположеппй о строении

8Эти формулы впервые описывали существоваппе двух аминокис­ лот, содержащих серу,— цистина и цистеина. Формула цистина предусматривала возможность образования дисульфпдного мо­ стика, правильное положение которого было определено позднее.

61