книги из ГПНТБ / Шамин А.Н. Развитие химии аминокислот

для выделения тирозина, лейцина' й глутаминовой кисло­ ты, которые ранее просто выбрасывали. Во-вторых, для обнаружения в этпх фракциях неизвестного вещества Риттхаузеиу пришлось искать новые способы осаждения и но­ вые ос-адптелп. В результате пм был открыт способ осажде­ ния аспарагиновой кислоты спиртом из обработанного углекислым барпем раствора. Этот метод, усовершенство­ ванный и расширенный, сыграл впоследствии важную роль в развптпп аналитической химии аминокислот под назва­ нием метода Форемана.

Едппствеппо, в чем ошибся Рпттхаузен, так это в ана­ лизе барпевоп соли выделенной аминокислоты. Он посчи­ тал, что она пмеет состав C8HuN2Oo. Поэтому сначала Риттхаузеп принял ее за новую аминокислоту и дал ей назва­ ние легумпповой, правда с оговоркой, что дальнейшие ис­ следования должны подтвердить правильность его заклю­ чения.

В *1868 г. Рпттхаузен опублпковал результаты дальней­ шего исследования нового вещества [37]. Цикл его ис­ следований аспарагиновой и глутампной кпслот является очепь показательным с точки зрения логики истолкования получаемых результатов эмпирического попска. Исходя из предположения, что перед ним повое вещество, Рпттхаузен объяснил трудпостп его очистки и переосаждеипя тем, что оно сильно загрязнено кристаллическими веществами ино­ го строения п некристаллическими соедииеппямп.

Однако дальнейшая работа по очистке этой смеси пока­ зала, что опа может быть успешно раскристаллизована. При этом, к удивлению Рпттхаузепа, образовывались крис­ таллы уже пзвестпых глутампповой и аспарагиновой кпс­ лот. Поэтому усилия ученого были направлены па поиски методов осаждения п очистки малых количеств аспараги­ новой кислоты и было получено окончательное доказатель­ ство ее присутствия в белковых гидролизатах.

Последующие анализы глутаминовой и аспарагиновой кислот привели Рпттхаузепа к мнению, что это гомологичпьте соединения. Он показал также, что аспарагиновая кислота образуется при гидролизе многих растительных белков. Почти одновременно аспарагиновая кислота была обнаружена В. Крейслером в казеине и яичном белке [38].

Доказательство присутствия в гидролизатах белков ала­ нина было получено не сразу. Это было сделано Т. Вейлем в 1888 г., но, вероятно, оно могло быть сделано со всей

42

достоверностью еще в 1875 г. П. Шютценберже, если бы не торопливость п небрежность, допущенные французским химиком.

П. Шютценберже и А. Буржуа подвергли шелк дейст­ вию Ва(ОН)2 в автоклаве при 150—200° С. Этот новый ме­ тод разложения белков впоследствии неоднократно исполь­ зовался в работах различных исследователей [39] и самого Шютценберже при попытках получить идентифицируемые фрагменты белковой молекулы. С ним была связана исто­ рия создания так называемой урепдной гипотезы строения белка [40]. Однако этот метод не всегда был удобен для выделения и идентификации аминокислот из-за возможно­ сти образования многочисленных вторичных продуктов. Авторы метода этого обстоятельства не учли. Поэтому ра­ боты Шютценберже пестрели описаниями аминопропзводных довольно сложного строения, присутствия которых в белковых гидролизатах ие могли подтвердить впоследствии другие ученые.

При гидролизе шелка Шютценберже и Буржуа оппсалп получение кристаллического тирозина (10%), смеси гли­ цина и аланина (60%), «аминомасляной кислоты» (10%) и «аминоакриловой кислоты» (20%). Но ни одно из этих соединений не было выделено в чистом виде и не подверг­ нуто достаточно достоверной идентификации. В 1879 г. Шютценберже опубликовал обширную статью, посвящен­ ную результатам изучения гидролиза яичного альбумина баритовой водой под давлением. На этот раз им былп вы­ делены кристаллические фракции, подвергнутые затем анализу [41]. Одна из фракций — вещество, которое обла­ дало элементным составом, на 0,2% отличающимся от состава аланина. Однако Шютценберже не сопоставил его с аланином. Работа Шютценберже невыгодно отличается от работы Э. Крамера.

Из-за небрежности оформления результатов и не­ последовательности в проведении исследования Шютцен­ берже лишился и чести первооткрывателя валина в соста­ ве белка. В работе [41] он также сообщил об открытии им в гидролизате яичного альбумина аминовалерпаиовой кислоты. Его «буталаиип» имел состав C5H 11NO2, но тож­ дественность с валином никак ие была подтверждена.

Лишь в 1888 г. Т. Вейлем были получены бесспорные доказательства присутствия аланина в белковых гидроли­ затах [42]. После осаждения тирозина в гидролизатах, нм

43

было получено при выпаривании аморфное вещество, со­ держание которого в гидролизате составляло около 15%. Вновь растворив вещество, он получил кристаллический осадок (пз разбавленного спирта с добавлением аммиака). Полученные кристаллы имели ромбовидную форму и при анализе оказалось, что они идентичны аланину. Вейль счи­ тал аланин амннопропионовой кислотой: «анализы показа­ ли наличие аланина (амннопропионовой кислоты)». Ала­ нии шелка, вероятно, является а-алаиином.

О работах Шютценберже и Буржуа Вейль либо не знал, либо но придавал им значения.

В 70—80-х годах XIX в. медленно укреплялось пред­ ставление, что знания о продуктах гидролиза белковых веществ несут в себе важную информацию о строении бел­ ковой молекулы. Начиная с середины XIX в., интенсивно изучались процессы разложения белков протеолитически­ ми ферментами. Возникли представления о пептонах и протеозах, изучение которых стало рассматриваться как наиболее верный путь к установлению строения белковой молекулы. Однако химики среди продуктов протеолиза белковых веществ, как правило, обнаруживали и амино­ кислоты.

Уже в 1870 г. русским химиком II. Н. Любавиным, ра­ ботавшим в лаборатории Ф. Гоппе-Зайлера, была высказа­ на гипотеза о преимущественно аминокислотном строении белка. Исследуя процессы гидролиза и протеолиза различ­ ных белков (казеина и альбумина), а также процессы раз­ ложения пептонов, Любавин отметил, что «белковые веще­ ства и пептоны сильно напоминают аминокислоты, и их уже известные продукты распада являются только амино­ кислотами (глнкоколлом, лейцином, тирозином, аспараги­ новой и глутаминовой кислотами)» [43, стр. 470]. Далее он показал, что гидролиз всегда, в конце концов, приводит лишь к образованию аминокислот, если не считать продук­ тов неопределенного строения, происхождение которых мо­ жет быть объяснено различными вторичными процессами или просто загрязнением препаратов.

Таким образом, уже в 1870 г. были созданы предпосыл­ ки развития химии аминокислот как важнейшей составной части химии белка. Мощный стимул получили попытки выделения новых аминокислот из белковых гидролизатов. Первые итоги этих работ мы уже видели. В составе белков были открыты серии, глутаминовая и аспарагиновая кис-

44

лоты и аланин. Э. Шульце п Й. Барбиерп открыли в соста­ ве растительных белков фенилаланин [44]. Но эти работы, особенно после разработки в 1873 г. метода гидролиза бел­ ков соляной кислотой Г. Глазиветцем и Й. Габерманом, привели к несколько необычной трактовке получаемых ре­ зультатов. Возникло представление, что в белках содер­ жится лишь ограниченное количество аминокислот, а именно: лейцин, тирозин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Все остальные аминокислоты, а также некоторые еще неидентифицпрованные примеси стали рассматривать­ ся как осколки этих веществ или как самые ближайшие производные, самообразование которых допускалось в ре­ зультате вторичных процессов. Во всяком случае «закон­ ность» их присутствия в гидролизатах вызывала сильные сомнения. Лишь в 1885 г. Э. Шульце и Барбиери пробили первую брешь в этих представлениях, доказав, что фенил­ аланин тоже является нормальным и часто встречающим­ ся продуктом распада многих белков [45, 46].

Гипотеза Любавина оказалась на два десятилетия ис­ каженной и полузабытой. Этому способствовало и то обсто­ ятельство, что опубликована его статья была в сборнике ра­ бот лаборатории Гоппе-Зайлера — издании, не получившем большого распространения и изданиом малым тиражом. Только в 1889 г., после работ Э. Дрекселя, начинаются важные изменения в подходе к проблеме состава продук­ тов гидролиза белков. Дрексель начал с уточнения деталей процесса гидролиза и скрупулезного анализа всех конечных его продуктов. Он подверг сомнению результаты Шютценберже и предложенную им уреидную гипотезу строения бел­ ка, но ограничился лишь указанием на потери вещества при обработке гидролизатов баритовой водой. Затем Дрек­ сель повторил опыты Глазиветца и Габермана, поставив себе цель исключить потери вещества при процессах гид­ ролиза и фракционирования. Гидролизуя казеин соляной кислотой в присутствии хлорида олова, Дрексель после удаления глутаминовой кислоты обрабатывал маточный раствор фосфорновольфрамовой кислотой. При этом выпа­ дал объемистый осадок, ранее теряемый химиками, кото­ рый подвергался дальнейшей очистке. В результате в ру­ ках Дрекселя оказались кристаллы, которые он попытался очистить переосаждением из спирта с примесью эфира. В результате было получено маслянистое вещество, кото­ рое частично кристаллизовалось. Полученные таким путем

45

кристаллы оказались гидрохлоридом какого-то достаточно сильного основания, а отнюдь не кислоты. Из них это ос­

делено еще одно вещество с формулой следующего вида

CsH10N2O2Cl2-PlCl,.-H2O, которое было, как предполагал Дрекссль, гомологом предыдущего.

Изучение этого вещества на первых порах дало лишь возможность объяснить образование избыточного С02 в опытах Шютценберже. Основание разлагалось под дей­ ствием баритовой воды с образованием карбоната бария [47]. Дальнейший ход исследований нового основания из белкового гидролизата весьма характерен. Он показывает также, насколько запутанными были представления о компонентах молекул белковых веществ, в частности, на­ сколько глубоко укоренившимся было убеждение о важ­ ной роли мочевины и ее производных в построении белка.

Дрекселем было выделено из гидролизата новое основа­ ние, которое, как он полагал, имело формулу CoHuN30 и было гомологом креатина (С^НДЧзО;.) и креатинина ((ДНЩзО). Чтобы доказать это положение, Дрексель об­ работал это основание барнтовой водой и среди продук­ тов распада обнаружил мочевину [48]. Это открытие счи­ тали чрезвычайно важным, чуть ли не ключевым, для вы­ яснения строения молекулы белка — впервые была полу­ чена мочевина из белка простым гидролизом! Новое ве­ щество получпло название «лизатии». Но это заключение оказалось ложным и не получило подтверждения.

Верным паправлеппем исследований по-прежнему ос­ тавалось тщательное изучение продуктов разложения бел­ ков и выявление наиболее стабильных из них при опреде­ ленных условиях гидролиза и последующих дробных осаждениях. Для того чтобы разобраться в том, что пред­ ставляют собой открытые основания, и не были ли эти от­ крытия ошибкой, понадобились многолетние усилия всей лаборатории Дрекселя в Лейпциге, особенно его учени­ ков — М. Зигфрида, С. Хедина и Эрнста Фишера.

Вместе с тем поиску и изучению основных веществ бел­ ковых гидролизатов не придавалось серьезного значения как вкладу в развитие химии аминокислот. Исследования Дрекселя и его группы преследовали цель уяснить детали

46

структуры фрагментов белковой молекулы, образующихся при ее распаде. Основным методом было разделенпе смеси осажденных фосфорповольфрамовой кислотой оснований

ивыделение их в виде различных солей.

В1891 г. М. Зигфрид пытался выделить осаждением

фосфорновольфрамовой кислотой основания из ряда бел­ ков и белковых препаратов [49]. Для разделения и очист­ ки продуктов гидролиза был использован нитрат сереб­ ра — реактив, который впоследствии сыграл важную роль в работах А. Косселя.

Зигфриду удалось выделить основание и определить состав его хлороплатипата: СвНггХгОз-РьСЬ, по перевести его в «лизатин» не удалось. Однако Зигфрид получил од­ ну и ту же соль из всех исследованных нм образцов. Это заставило Дрекселя и его сотрудников продолжить изуче­ ние оснований, получаемых при гидролизе белков. И лишь в результате совместных усилий Эрнста Фишера и С. Хедина удалось выделить из гидролизата достаточно определениое соединение — дихлорпд, который очепь бы­ стро спонтанно разлагался с образованием днампнокапроновой кислоты [50]. Свободному основанию приписыва­ лась формула C6HuN20 2. Правильная структура его в мо­ мент выделения этого соединения устаповлеиа не была. Для обозначения этого основания Эрнест Фишер предло­ жил название «лизин». Характерно, что Фишер получил лизин также щелочиым гидролизом желатина под давле­ нием, а поэтому лизин должен был быть в гидролизатах, которые изучал Шютценберже.

Работы Дрекселя завершились попытками выделения лизина в чистом виде, но ие увенчались полным успехом. Однако Дрексель сумел сделать правильное предположе­ ние о строении лизина как производном пентаметилендпамина. Это было подкреплено наблюдением А. Эллппгера, который в 1899 г. показал, что при анаэробном гнпенип лизина образовывался пентаметплендиампн [51], что, од­ нако, привело к созданию ложных представлений о строе­ нии лизина как аминокислоты.

Открытие лизина окончательно изменило представ­ ления об аминокислотах как определенной группе органи­ ческих соединений, образующих гомологический ряд и об­ ладающих близкими свойствами. Представления об основ­ ных аминокислотах значительно повлияли па исследова­ ния белковых веществ и на построение гипотез об их стро-

47

етшп. Гипотезы М. Зигфрида и А. Косселя были в значи­ тельной мере обусловлены этими открытиями.

Выделение лизина было быстро признано и приобрело большой вес, поскольку ему предшествовало в какой-то мере узаконенное работами Дрекселя открытие первой основной аминокислоты — аргинина.

В I860 г. Э. Шульце и Э. Штейгер из экстрактов этио­ лированных проростков люпина выделили новое вещество, обладающее выраженными основными свойствами. Имен­ но в этом случае была впервые с успехом использована фосфорновольфрамовая кислота для осаждения основа­ ний [52]. После очистки водного экстракта от высоко­ молекулярных соединений немецкие хпмпкн обрабатывали раствор фосфорновольфрамовой кислотой. Осадок обраба­ тывали Са(ОН): и пейтралнзовывалп азотпой кислотой. Из полученного раствора довольно легко были выделены кристаллы азотнокислой соли нового соединения, назван­ ного аргпнпном. Его эмпирическая формула была опреде­ лена сразу же п с безукоризненной точностью. Было по­ казано, что новое вещество достаточно легко может быть получено различными способами. Его свойства не позво­ лили сопоставить его с уже известными аминокислотами, но оно сравнивалось с креатинином3.

Шульце приступил к более детальному изучению этого соединения и его производных. Былп отмечены его устойчивость к действию кислот, но лабильность по от­ ношению к щелочам. Шульце не связывал аргинпп

вых гпдролизатах заставили Шульце иначе взглянуть на роль и место аргпнппа в веществах растительного проис­ хождения. Прп этом Шульце впервые высказал предполо­ жение, что при прорастании семян белки превращаются в вещества, содержащие аргинпи. Таким образом,- утвер­ ждалась прямая связь аргппииа с процессами превраще­ ния белков [53]. В J891 г. Шульце сразу же сопоставил открытый нм аргинин с лпзином Дрекселя.

Группа Дрекселя приняла признание Шульце как сви­ детельство правпльностп избранного пми пути. Продол-

3 Через несколько лет открытые основные белкп — протампны и гистоны — также пе были отнесены сразу к истинным белкам и долгое время занимали положение неопределенной группы, пока не была доказана пх аминокислотная природа.

43

жеыные ими с энтузиазмом исследования позволили от­ крыть еще одно новое аминопропзводпое в гидролизатах

дования, где наибольших! успех зависел от наиболее пол­ ной реализации возможностей разработанпой системы ме­ тодологических приемов. Но вместе с тем работы группы Дрекселя — пример методологическом ограниченности, присущей для этого этапа развития химии аминокислот и типологии исследований.

М. Зигфрид пытался разработать воспроизводимый ме­ тод выделения «лизатина» и получил ряд препаратов, бо­ лее или менее постоянных по своему составу. Однако ис­ следователь упустил открытие гистидина, который он «имел в пробирке», ио не сумел очистить и идентифици­ ровать [54].

Эрнст Фишер тщетно пытался выделить «лизатин» и доказать его связь с лизином [55]. И только Хедииу, на­ чинающему химику, «ие мастеру, но подмастерью», уда­ лось в процессе поисков «лизатииа» не только выделить впервые из белкового гидролизата аргпнии [56], но и от­ крыть новую аминокислоту — гистидин [57]. Ему удалось объяснить и неудачи с лизатином. Оценка этих работ пре­ красно дана Виккери и Шмидтом: «И аргинин, и лизатин образуют две соли серебра. Двойная соль нитрата серебра аргинина сравнительно нерастворима и образуется легко. Кислая двойная соль нитрата серебра аргинина более ра­ створима. Кислая двойная соль нитрата серебра лизина, несомненно, растворима, ио его нейтральная или слабо­ щелочная двойная соль нитрата серебра растворима очень хорошо. Пары соединений аналогичны, ио растворимость их обратного порядка. Когда осиоваиия находятся в рас­ творе вместе с добавленным нитратом серебра и раствор обрабатывается спиртом и эфиром, ... отделяется смесь двух менее растворимых солей, а именно нитрат серебра аргинина и кислый нитрат серебра лизина. Продукт, по­ лученный Дрекселем, Зигфридом, Фишером и им самим (Хедппым.— А. Ш., И. Д.), признанный нитратом серебра лизатииа, имел состав, примерно промежуточный между нитратами серебра аргипина и лизииа» [58].

Хедин писал: «Хотя из моих опытов недвусмысленно вытекает, что лизатин как химический индивид не сущест­ вует, но, тем не менее, можно наглядно доказать, что име-

49

метод осаждения этого вещества сульфатом серебра, кото­ рый приводил к получению кристаллов свободного основа­ ния с формулой С0Н9ХзО2 и молекулярным весом 155,4. Выделенное вещество было слабощелочным.

Оценивая открытие гистидина, Виккери и Шмидт пи­ сали: «Одновременное открытие гистидина двумя отда­ ленными друг от друга лабораториями, проводившими по­ следования в совершенно различных направлениях, пред­ ставляет особый интерес. Хедин нашел лучший метод выделения, чем Коссель, его препараты были чище, а ана­ литическая работа незаурядна. Кроме того, исследование протекало логически. С другой стороны, Коссель был ис­ следователем другой области. Это была его первая работа в этом направлении и после этого его имя стало крепко связано с ним. То, что он непосредственно применил труд­ ный метод гидролиза для разложения нового белка, было гениально, однако использование им хлорида ртути было не избирательно и ему повезло, что он получил чистый продукт. Хлорид ртути — неселективный реактив для ще­ лочных растворов, но продукты гидролиза протамина со­ держали, кроме аргинина, очень мало других аминокис­ лот, чтобы осадок содержал их вместе с гистидином» [58]. И далее Виккери и Шмидт отмечали, что «Коссель и Хедпи имеют одинаковые заслуги в открытии гистидина как независимые открыватели его»; Коссель дал название ве­ ществу в 1896 г., Хедин в 1898 г., ссылаясь на три основа­ ния, производные белков, писал: «После основания — лизи­ на, мною были найдены аргинин и гистидин». Вероятно, справедливо будет считать Косселя первооткрывателем гистидина, обнаружившим его в протамииах, а Хедина — первооткрывателем, нашедшим его в белках [50].

. Своего рода сенсацией было открытие аминокислоты, содержащей иод — дииодтирозина, или иодогоргоевой ки­ слоты, как она была названа вначале.

Данные о содержании иода в морских водорослях и животных были получены еще в первой половине XIX в. В 90-х годах XIX в. стало известно о его важной физио­ логической роли, а в 1895—1896 гг. Бауман открыл, что иод содержится в ткани щитовидной железы животных. Вслед за этим Дрексель выделил новую иодсодержащую аминокислоту [62].

Это открытие сделано Дрекселем во время работы на Морской зоологической станции в Неаполе, своего рода

51