книги из ГПНТБ / Шамин А.Н. Развитие химии аминокислот

ответвлениями — от асимметрического синтеза и методов экспериментального определения геометрических пара­ метров молекул до важнейших квантовохпмическпх обоб­ щений. Хотя основное развитие стереохимии шло по ли­ нии изучения неприродных органических соединений, однако некоторые основополагающие наблюдения п за­ ключения были сделаны иа типичных биооргаиических объектах. Таковы были паблюдепня Л. Пастера над оп­ тическим вращением органических кислот. Таково было открытие вальдеповского обращепия, о котором Эмиль Фишер писал: «Это открытие со времени основополагаю­ щих исследований Пастера было самым поразительным наблюдением в области оптически активных веществ» [2, стр. 489]. Таково, наконец, было развитие рентгеноструктурного анализа, сразу ориентированного Дж. Бер­ налом на изучение аминокислот, белков и их компонентов.

Наиболее разительные и имеющие большие послед­ ствия пзмеиенпя в исследованиях аминокислот произо­ шли за период с 20-х по начало 50-х годов XX в. в области их аналитической химии.

Развитие аналитической химии аминокислот

После работ А. Косселя и особенно Э. Фишера дальней­ шее развитие химии белка связывали с успехами в двух областях — в области синтеза модельных соединений и анализа аминокислот. Однако и в той, и в другой области вскоре после работ Э. Фишера наступил кризис, вызван­ ный в области синтеза глубокими методологическими при­ чинами — неправильной ориентацией большинства преем­ ников Э. Фишера на дикетопиперазиповую теорию, а в области аналитической химии аминокислот — ограниче­ ниями, накладываемыми отсутствием удовлетворительных методов анализа.

Как писал Г. Тристрам: «Большинство классических методов, основанных на оригинальных исследованиях

Н. Д.) и требовали выделения аминокислоты или одного из ее производных. Обширная литература по этому вопросу свидетельствует о громадных трудностях, сопутствующих таким исследованиям. Применение классических методов ограничивалось в значительной степени тем, что для ис-

92

следований требовались большие количества белка (100 г или более). Существовавшие в то время колориметриче­ ские методы нельзя было проверить путем анализа ами­ нокислотных смесей, составленных специально для данной цели ввиду отсутствия чистых амипокпслот (не было ме­ тодов надежной оценки их чистоты)» [3, стр. 209]. Это высказывание достаточно четко формулирует и суммирует основные недостатки методов анализа амипокпслот в пе­ риод проверки пептидной теорпи.

После вооружения бноорганической химии новейши­ ми методами микроанализа развитие аналитической химии аминокислот на этапе гравиметрических методов кажется неоправданно медленным и лишенным перспек­ тивы. Однако это не совсем так. В 10—30-е годы XX в. аналитическая химия аминокислот была одной пз наибо­ лее трудоемких и сложных областей аналитической орга­ нической химии. И успехи химии белков в эти годы свя­ заны в значительной мере с успехом в развитии именно гравиметрических методов анализа.

Помимо вопросов строения белка было еще одно на­ правление, которое сильно влияло и столь же сильно зависело от развития аналитической химии аминокис­ лот,— изучение питательной ценности белков. Именно аналитические методы, разработанные в этот период, по­ зволили сделать важное заключение о существованпн не­ заменимых аминокислот, ввести на этом основании клас­ сификацию белков по пх пищевой ценности. «Значение аминокислот как основного фактора во всех проблемах, связанных с белком, все более подчеркивается в исследо­ ваниях по химии питания... Очевидно, что неодинаковая питательная ценность различных белков связана с различ­ ным содержанием в них тех специальных аминокислот, которые необходимы для организма и не могут быть син­ тезированы животным» (цпт. по [4, стр. 7]). Эти слова Т. Осборна и Л. Менделя подчеркивают всю важность и значение разработки удобных п быстрых методов анализа амипокпслот. Многие из разработанных в конце XIX в.— начале XX в. методов анализа аминокислот — индивиду­ альных пли групповых — продолжали рекомендовать для лабораторной практики вплоть до 50-х годов XX в. [4].

Наконец, эти исследования, как можно видеть из приведенного высказывания Осборна п Менделя, были теснейшим образом связаны с первыми шагами в изуче-

93

нии обмена аминокислот в организме, как животном, так и растительном [5, 6]. Перелом в представлениях об ами­ нокислотном обмене у растении, в частности в представ­ лениях о роли ампдов — аспарагппа и глутамина, также связан с развптпем гравиметрических методов анализа амппокнслот. Большие надежды связывали с аналитиче­ ской химией амппокнслот и при изучении вопроса о судь­ бе свободных ампиокпслот в организме — растительном НЛП животном.

Методы анализа ампиокпслот во времена Э. Фигнера стали подразделять па две группы, которые имели неко­ торое существенное различие, а пмепно: па методы оп­ ределения аминокислот в белках (вернее, белковых гидро­ лизатах) и на методы определения индивидуальных ами­ нокислот. Это деление сложилось исторически.

Методы определения индивидуальных аминокислот, чаще всего колориметрические, были итогом усовершен­ ствования некоторых цветных проб на белки и не всегда строго учитывали индивидуальные свойства ампиокпслот. Для анализа триптофана с f901 по 1925 г. было разрабо­ тано 20 методов, из них только два гравиметрических и два объемных, остальные — колориметрические; для ти­ розина за тот же срок было разработано 14 методов, из них одни гравиметрический. Кроме того, методы опреде­ ления ппдпвндуальпых аминокислот были неприемлемы для смесей аминокислот, каковыми являлись гидролизаты и некоторые вытяжкп тканей. Методы определения ами­ нокислот в гидролизатах, как правило, были следствием развития групповых методов, основанных па некоторых общих свойствах ампиокпслот.

В методах определения индивидуальных амппокнслот мешающими факторами могли быть как примесь других ампиокпслот, так и некоторые иные вещества, например, включающие нидольпую группировку в случае триптофа­ на, пли сульфгпдрпльные группы в случае цпстппа-ци- стенна. В групповых анализах эти помехи пе всегда игра­ ли существенную роль. Однако для последних методов, как правило весовых, характерна зависимость от методов определения азота (как общего, так и аминного) в белках, так как сопоставление содержания идентифицированного или неидеитпфицированного азота в аминокислотах с об­ щим азотом белка считалось важным показателем резуль­ татов анализа.

94

В определении азота центральное место занимал метод И. Кьсльдаля, разработанный еще в 1883 г. [7]. Чрезвы­ чайно большую роль играл метод определения амппоазота Д. Ван Слайка, предложенный в 1911 г. [8] п его много­ численные модификации [9], разработанные в 20-х годах. Широко использовались методы определения карбоксиль­ ных групп, в том числе метод С. Соренсена [10] п другие [11], а также многочисленные модификации нипгпдрнпиых проб [12—14], разработанные в 1910—1918 гг. — все это было обязательным дополнением к любому аналитиче­ скому исследованию аминокислот.

При рассмотрении развития, методов аналитической химии аминокислот мы не будем вдаваться в детали от­ дельных методик, отсылая желающих ознакомиться с ними к специальным монографиям: Р. Блока п Д. Бол­ линга [4], Г. Митчела и Т. Гамильтона [15], к сборникам «Белки» [16] и, наконец, к ежегодникам «Успехи химии белка», регулярно издающимся с 1944 г., в которых пуб­ ликуются статьи по аналитической химии белков и аминокислот [17].

Эфирный метод Эмиля Фишера являлся логическим (ио не чисто методическим) развитием групповых мето­ дов определения аминокислот, а также методическим раз­ витием доведенных до ювелирной тонкости препаративных методик. Методу Э. Фишера предшествовали групповые методы, созданные В. Гаусмаиом (в лаборатории Ф. Гоф­ мейстера), который определил в белке три фракции азота (амидный, диампнокпслот и моиоампнокпслот) (1899 г.) [18], и А. Косселя и Ф. Кутчера (1900 г.) [19], опреде­ лявших диамипокислоты — аргинин, гистидин и лизин. Оба метода были неоднократно модифицированы, особен­ но ценный для хпмиков-белковнков метод Косселя-Кутче- ра, который за 15 лет был усовершенствован 6 раз, причем трижды самим Косселем.

Однако эти методы пе давали никакого представления об аминокислотном составе белков в целом. И только Э. Фишеру удалось создать ныне кажущуюся громоздкой и неуклюжей систему приемов, позволяющих провести полный аминокислотный анализ белковых гидролизатов.

В чем состояло нововведение Э. Фишера? Метод Кос- селя-Кутчера был основан на образовании нерастворимых серебряных солей аргинина и гистидина и сводился к дробному осаждению. Т. Курциус предложил использо-

95

вать хлоргйдраты эфиров аминокислот. Э. Фишер раз­ работал метод разгонки эфиров как основу разделе­ ния.

Методу Э. Фишера было суждено долго оставаться единственным методом анализа смесей аминокислот. Все остальные методы, проявившиеся в первые три десятиле­ тия XX в., сводились лишь к иопыткам усовершенство­ вания амииокнслотиого анализа разогнанных по Фишеру фракций п к разработке более и л и менее удобных методов определений отдельных аминокислот и л и группировок — карбоксильных, аминных и других групп. Так, метод Ф. Форемана определения аспарагиновой и глутаминовой кислот осаждением кальциевых солей спиртом, разрабо­ танный в 1914 г., возрождал забытый метод Г. Рнттхаузена 1869 г. [20, 21]. Эта методика, послужившая осно­ вой для многих модификаций, была типично групповой, дающей лишь ограниченную информацию об аминокис­ лотном составе белка.

Кроме метода Ван Слайка для определения азота амино­ групп был создай ряд методов для определения карбок­ сильных, сульфогндрильных н аминогрупп в белках. Это была еще одна группа методов, позволявшая получить сведения об общем содержании аминокислот в той или иной форме в молекуле белка, а также аминокислот в сме­ си. Так, метод формольного титрования, разработанный С. Соренсеном, позволял определять количество карбок­ сильных групп аминокислот в растворе. Этот метод полу­ чил значительное распространение, так же как и метод Ban Слайка.

Метод Р. Эягелапда (1909 г.) позволял определить аминогруппу метилированием метилиодидом в щелочном растворе:

R—СИ—NHs + ЗСГЫ + ЗКаОН -»

!1

соон

— 3NaJ + НаО + П—СН—Гч'(СНз)з

I I

со-о

Последние кристаллизовали в виде ауратов.

Предпринимались попытки превратить подобные мето­ ды в общие методы анализа аминокислот. Так, Ван Слайк создал в 1911—1913 гг. довольно сложную процедуру,

96

позволяющую определить отдельные аминокислоты в сме­ си, причем некоторые аминокислоты определяли косвенно, вычислением по группам [23, 24].

В 1928 г. Г. Дэкпп [25] предложил метод, с которым связывали большие надежды. Считалось, что он сможет заменить метод Э. Фишера. Дэкпи показал, что мопоампномонокарбоиовые кислоты можно извлечь из раствора при помощи бутилового и изопропилового спиртов. Однако метод оказался неприменимым для количественного вы­ деления аминокислот, в том числе моноаминокислот от дпамино- и дикарбоиовых кислот, т. е. именно для того, для чего ои и создавался. Эта неудача Дэкпна, большого знатока экспериментальной химии белка, еще раз показа­ ла, сколь сложен путь совершенствования способов ана­ лиза аминокислот.

В 1922 г. О. Фолии [26] предложил количественный колориметрический метод анализа аминокислот с (1-нафто- хинопсульфоиовой кислотой, по этот метод не позволял дифференцированно определять аминокислоты.

Заметные успехи в 10—30-е годы XX столетия были достигнуты в разработке методов определения отдельных аминокислот. При этом характерным было следующее: наибольшее число максимально точных и удобных методов было предложено для аминокислот с характерными боко­ выми цепями или активными группами боковых цепей — тирозина, триптофана, цистина, аргинина. Практически не продвинулось вперед по сравнению с уже существующими методами определение дикарбоиовых кислот — глутамино­ вой и аспарагиновой. Эти кислоты по-прежнему опреде­ ляли гравиметрически в виде солей со значительными потерями н ошибками. Практически только этерифика­ цией по Э. Фишеру можно было определить другие амино­ кислоты.

Таким образом, имела место определенная зависимость развития методов определения от структуры объекта: для более характерных соединений подбирались более или менее специфические процедуры. При этом далеко не все­ гда имело место совпадение устремлений химиков, изуча­ ющих структуру или аминокислотный состав белков, со­ держание или превращение отдельных аминокислот в тка­ нях и органах, с возможностями аналитической химии аминокислот. Существовала определенная зависимость этих исследований от набора методов или даже типов апа-

лпза: мы уже отмечали распространение гравиметриче­ ских методов в групповом анализе аминокислот и колори­ метрических при анализе отдельных аминокислот. Разра­ ботка того или иного приема, так же как и выбор объекта анализа, представлялась случайной, почти не зависящей от воли и желания исследователей.

После Фишера, для которого был характерен универ­ сальный подход, наиболее крупные силы ученых сосредоточплпсь в рядах аналитиков. «Исследователи аминокис­ лот находятся среди элиты науки»,— писали в 1931 г. Г. Впккерн и К. Шмпдт [27, стр. 169]. Вместе с тем теоретики, генерировавшие одну за другой гипотезы стро­ ения белка, требующие строгой аналитической проверки, почтп полностью утратили интерес к кропотливой анали­ тической работе. В результате этого в 30-е годы в основ­ ном исследуются лишь аминокислотный состав и содержа­ ние отдельных аминокислот в белках. Эти работы гораздо более прочно вошли в историю химии белка, чем много­ численные гипотезы циклического строения белковой мо­ лекулы.

Одновременно началось широкое использование мето­ дов анализа аминокислот врачамп и биохимиками. В част­ ности, прямые биохимические запросы определили появ­ ление ряда колориметрических методов определения тиро­ зина и триптофана Фолпна (О. Фолппа п В. Денниса, •1912 г.; О. Фолппа и Дж. Лунся, 1922 г.; О. Фолппа и В. Чокылтя, 1927 г.); последний метод получил особенно большое распространение.

Общий же итог трех десятилетий развития аналити­ ческой химии аминокислот был далеко не удовлетвори­ тельным. Г. Митчелл и Т. Гамильтон в своей монографии 1929 г. суммировали: «При использовании всех доступ­ ных методов только половина из девятнадцати известных аминокислот может быть определена с известной сте­ пенью точности» [8, стр. 142].

Вместе с тем развитие пептидной теории поставило вопрос о взапмоположеипп, а затем о законах распреде­ ления и последовательности аминокислот в полипептидной цепи. Успехи в области синтеза полиампнокислот (в 30—40-е годы — олигоаминокислот) [28], появление ги­ потезы «перемежающихся частот» М. Бергмана и К. Нимана и привлечение к пей широкого внимания [29] сно­ ва остро дало почувствовать отставание аналитической

98

химии аминокислот по сравнению с развитием химии бел­ ка в целом.

В 1945 г. А. Мартин и Р. Сипг, создатели метода рас­ пределительной хроматографии иа бумаге, революциони­ зировавшего аналитическую химию белка и аминокислот, признавались: «Многие усовершенствования за последнее время, несомненно, были вызваны желанием подтвердить или опровергнуть гипотезу строения белка Бергмана и Нпмана в той части, в какой она касалась полного ами­ нокислотного состава». При этом они тут же добавляли: «Современные аналитические методы едва ли способны разрешить эту задачу даже для отдельных аминокислот. Однако имеются серьезные основания полагать, что че­ рез несколько лет проблема анализа белковых гидроли­ затов или аминокислот будет разрешена в такой мере, что центр тяжести проблемы будет заключаться в соответ­ ствии состава гидролизата составу белка, из которого он получен» [30, стр. 46].

С середины 30-х годов все больше внимания обращают па способность аминокислот адсорбироваться различными веществами и на возможность использования этой спо­ собности для разделения и анализа аминокислот. Хотя отдельные наблюдения подобного рода и даже попытки включить их в качественные методики предпринимались еще во времена Фишера О. Фолиным [31], Э. Абдергальдеиом и А. Фодором [32], разработка количественных ме­ тодов на этой основе была начата лишь в годы второй ми­ ровой войны [33—35].

г Хроматография и аминокислотный анализ

История создания хроматографического анализа представ­ ляет самостоятельный интерес и заслуживает подробного изложения ’. Мы остановимся лишь па принципиальных работах, которые сделали метод хроматографии, во-пер­ вых, всеобщим, применительно к аминокислотам, вовторых, количественным и, в-третьих, позволили опери­ ровать с микроколнчествамп белка, аминокислот и белко­ вых гидролизатов.1

1 История хроматографического анализа была рассмотрена в не­ скольких работах (см., например, [36, 37]).

Все это вместо взятое послужило отправной точкой для той огромной, но проведенной исключительными тем­ пами работы по изучению аминокислотного состава белка, о цели которой В. Стейн сказал: «Для выяснения струк­ туры белка необходимо иметь точные и полные сведения об аминокислотном составе большого числа различных

созданию многочисленных, принципиально новых методов анализа аминокислот (микробиологических, изотопных и других). В начале 50-х годов революция в методах анали­ за выразилась в автоматизации аналитических процессов; после чего развитие химии аминокислот и белков приоб­ рело существенно новые черты.

Хроматографические методы для анализа аминокислот пытались применить еще в 30—40-е годы, по с качествен­ ными и препаративными целями. Одиако приложение хроматографических методов к исследованию водораство­ римых веществ отставало по сравнению с анализами жи­ рорастворимых веществ [39, 40]. Но уже к 1943 г. Т. Вилапд опубликовал обзор специально хроматографических методов анализа аминокислот [41], в котором разделил хроматографию на три группы методов: адсорбционные, обменные и распределительные. Это деление было в значи­ тельной мере условно и не совсем правильно отражало ис­ тинную классификацию хроматографических методов [42, стр. 750], по именно это деление сохранилось в описании хроматографических методов анализа аминокислот на весь рассматриваемый нами период (до конца 50-х годов XX в.). Современное определение хроматографии 2 также отличается от определения 40-х годов: хроматография — «технический прием анализа путем пропускания жидко­ сти через порошкообразное пли пористое вещество, безот­ носительно к природе физико-химического процесса, ко­ торый может приводить к разделению вещества в при­ боре» [43].

Мы привели это определение, данное создателями рас­ пределительной хроматографии, для того чтобы подчерк-

2 «Хроматография — разделение смесей газов, ларов, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динами­ ческих условиях» [42, стр. 750].

100

путь широкое толкование, имевшее хождение в описыва­ емый период.

Одно из наиболее ранних успешных разделений ами­ нокислот было осуществлено Ф. Турба в 1941 г. [44]. С помощью двух коммерческих адсорбентов типа фуллоровой земли он произвел количественное отделение гисти­ дина, лизина и аргинина от всех остальных нейтральных и кислых аминокислот. Адсорбированные и затем элюи­ рованные аминокислоты определяли по Ван Слайку, сте­ пень разделения достигала 98—100%.

В том же году для разделения аминокислот стали ис­ пользовать колонки с АЬО.ч, а также синтетические ионообменные смолы [45, 46]. В дальпейшем обменные методы были с успехом применены для разделения днкарбопопых н моноампномоиокарбоиовых кислот [47, 48]. Все перечисленные методы, несмотря па значительную чув­ ствительность, тем не мепее страдали общим недостатком, характерным п для старых гравиметрических и колори­ метрических методов,— они не были всеобщими, а остава­ лись специально разработанными для отдельных амино­ кислот пли их групп и часто капризными при изменении условий.

Поэтому в начале 40-х годов более перспективными считались «истинно адсорбционные» методы, где в каче­ стве активного вещества использовались активированный уголь и некоторые другие сорбирующие вещества, в том числе синтетические смолы. В развитие методов этого типа наиболее важный вклад внес А. Тпзелиус [49]. Од­ нако в данном случае прогресс хроматографии оказался связанным ие столько с преимуществами сорбционных приемов, сколько с изобретением новых методических при­ емов, видоизменивших технику хроматографического ана­ лиза. Тизелиус ввел фронтальный анализ и впервые ис­ пользовал технику вытеснительного проявления.

При фронтальном анализе ие использовалось обычно применяемое проявление. Исследуемая среда непрерывно вводилась в колонку с активированным углем, а вытека­ ющий раствор контролировался одним из оптических ме­ тодов, которые были разработаны в лабораториях швед­ ских химиков Т. Свсдберга и А. Тизелиуса для методов ультрацентрифугироваиня и электрофореза (см. [50]). Полученные кривые были кривыми градиента концентра­ ции, а не самой концентрации. Скорость движения фрои-

101