книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

1.6.4.1. При этом высота столбика смолы должна быть 26 см. Для заполнения колонки используют 0,2 н. натрийцитратный бу­ фер pH 3,545 (0,20 М по цитрату). Условия анализа описаны в разд. 1.6.6.

1.6.5.Методика анализа физиологических жидкостей

По этой методике анализируют аминокислоты и родственные им соединения, реагирующие с нингидрином, которые обычно присутствуют в физиологических жидкостях. Перечень этих сое­ динений приведен в разд. 1.3.1.2. Ниже подробно описаны про­ цедуры анализа физиологических жидкостей на смолах UR-30

и UR-40.

1.6.5.1.Анализ с использованием смолы UR-30

Анализ кислых и нейтральных аминокислот с использова­ нием натрийцитратных буферов. Для этой цели можно исполь­ зовать ту же колонку длиной 56 см, которая применяется для анализа белковых гидролизатов. Заполнение колонки описано в разд. 1.6.4. Режим анализа следующий: скорость подачи бу­ фера 50 мл/ч, нингидринового реагента — 25 мл/ч; стартовый буфер — 0,2 и. натрийцитратный буфер с pH 3,20 + 0,01, не со­ держащий детергента (табл. За); начальная температура 32,3°С. Через 90 мин после начала анализа температуру колонки повы­ шают до 62,0°С (постепенно, в течение 55—60 мин). Через 158 мин после начала анализа стартовый буфер заменяют 0,2 н. натрийцитратным буфером с pH 4,26+0,02. Нормальное давле­ ние на колонке при 32,3 °С составляет 12,7 атм; весь анализ про­ ходит за 320 мин. Типичная кривая показана на рис. 2.

Анализ основных аминокислот. Для анализа этих аминокис­ лот используют смолу РА-35 при высоте столбика смолы 23 см. Скорость подачи буфера и нингидринового реагента та.же, что и при анализе кислых и нейтральных аминокислот. Анализ на­ чинают с 0,38 н. натрийцитратного буфера pH 4,25 + 0,01 (см. табл. За) при 32,3 °С, который на 185-й минуте заменяют на 0,35 н. натрийцитратный буфер pH 5,36 + 0,01; одновременно по­ вышают и температуру в рубашке колонки до 62,0 °С, используя тот же температурный градиент. Нормальное давление на ко­ лонке при 32,3 °С составляет 14,8 атм, а продолжительность ана­ лиза— 345 мин (см. рис. 2). В целом анализ кислых, нейтраль­ ных и основных аминокислот физиологических жидкостей зани­ мает немногим более 11 ч.

Анализ кислых и нейтральных аминокислот с использованием литийцитратных буферов. Разделение аспарагина и глутамина в присутствии других аминокислот всегда представляет собой

непростую задачу. Для анализа этих двух аминокислот были описаны методы с программированием температуры [151], а так­ же ферментативные методы. Определение одного аспарагина в плазме крови разработал Барри [153]. Мур и Стейн [2] лишь упоминали о возможности использования литийцитратных бу­ феров в ионообменной хроматографии. Бенсон с сотр. [150], ос­ новываясь на работе Мура и Стейна, разработал методику ана­ лиза глутамина и аспарагина в присутствии других аминокислот.

Считают, что различие в разделении аминокислот при исполь­ зовании литийили натрийцитратных буферов обусловлено, повидимому, гидратацией. Хефтман [29] объясняет, что скорость ионного обмена в первую очередь контролируется процессом диффузии ионов из смолы и что наименее прочно связываются наиболее гидратированные ионы. Гидратированный ион лития имеет 7,3—10,0 А в диаметре, тогда как ион натрия—5,6—7,9 А. При использовании смолы UR-30 продолжительность анализа кислых и нейтральных аминокислот физиологических жидкостей составляет 270 мин, включая определение (3-аминоизомасляной кислоты.

Заполнение колонки. Вначале смолу переводят из натриевой формы в литиевую. Для этого смолу помещают на воронку Бюхнера и промывают десятью объемами 2%-ной гидроокиси лития, затем десятью объемами деионизированной воды и окон­ чательно десятью объемами стартового буфера. После этого смолу оставляют на ночь в стартовом литийцитратном буфере, чтобы полностью перевести ее в литиевую форму.

Таблица 36

ЛИТИПЦИТ РАТНЫЕ БУФЕРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА КИСЛЫХ И НЕЙТРАЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СМОЛЫ UR-30

25 К-НЫЙ раствор, очищенный («Pierce Chemical Company»).

Колонку размером 69-0,9 см заполняют смолой до высоты

70 ГЛАВА Т

полный анализ всех аминокислот физиологических жидкостей потребуется немногим более 6 ч.

На рис. 5 показана хроматограмма разделения синтетичес­ кой смеси основных аминокислот.

1.6.6.Ускоренный одноколоночный метод анализа белковых гидролизатов

Помимо ускоренного анализа кислых, нейтральных и основ­ ных аминокислот, проводимого на двух колонках, использова­ ние смол UR-30 и UR-40 дает возможность 1) анализировать на одной колонке кислые, нейтральные и основные аминокислоты в ускоренном режиме; 2) выполнять анализы при меньшем дав­ лении, чем при использовании ранее описанных смол в одинако­ вых условиях; 3) улучшить разделение аминокислот.

1.6.6.1.Одноколоночный анализ с использованием смолы UR-30

Колонку заполняют смолой до высоты 56 см. Анализ прово­ дят по следующему режиму. Скорость подачи буфера и нингидринового реагента равна соответственно 130 и 65 мл/ч. Анализ начинают с элюирования 0,20 н. натрийцитратным буфером pH 3,28 ±0,02, который через 37 мин заменяют на 0,20 н. натрийцитратный буфер с pH 4,30 ± 0,02. Начальная температура ко­ лонки 55,6°С. Через 42 мин температуру постепенно повышают до 64,8°С (в течение 55—60 мин). На 54-й минуте производят за­ мену на третий буфер (1,0 н. цитрат натрия, pH 6,71) для элюи­ рования основных аминокислот. Рабочее давление в конце ана­ лиза 29,9 кгс/см2, продолжительность анализа 150 мин (рис. 6). Состав буферов приведен в табл. 2.

Обсуждение. По этой простой методике анализа белковых гидролизатов можно определять 23 соединения, включая обыч­ ные аминокислоты. Однако если эти аминокислоты содержатся в физиологических жидкостях, таких, как плазма крови, моча, гомогенаты тканей, то для полного анализа требуется более сложная методика. При одноколоночном методе анализа отпа­ дает необходимость регенерации колонки * и уравновешивания смолы буфером.

При анализе плазмы по этой методике цитруллин элюируется вместе с пролином, а аспарагин и глутамин вымываются вместе с серином. Содержание глутамина и аспарагина можно опреде­ лить после проведения кислотного гидролиза.

* Без регенерации щелочью на колонке могут задерживаться пептиды и продукты деструкции некоторых аминокислот,-образующиеся при кислотном гидролизе белков. Эти продукты могут исказить последующие анализы. —

Прим, перев.