книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

Ранние исследования по хроматографии аминокислот и пеп­ тидов показали, что для сокращения продолжительности ана­ лиза необходимы смолы с малым размером зерна, поскольку в этом случае быстрее достигается состояние равновесия между аминокислотами и окружающим раствором. (Трудности с полу­ чением воспроизводимых результатов от партии к партии встре­ чаются даже при использовании смол с размером зерна менее 400 меш.) Размалыванием такого сферического полимера полу­ чают мельчайшие порошкообразные частицы, улучшающие раз­ деление и позволяющие ускорить анализ. Однако выход целе­ вого продукта чрезвычайно мал и, кроме того, требуется очистка смолы от примесей. Сферические смолы, полученные специфиче­ скими методами из мономеров, позволяют еще в большей сте­ пени сократить время анализа и улучшить разделение [88].

Аминокислоты представляют собой органические соединения, содержащие по меньшей мере одну карбоксильную (кислую) группу и одну аминогруппу (основную), находящуюся в а-поло- жении по отношению к карбоксильной группе. Когда аминокис­ лота хроматографируется на колонке с катионообменником

(—SO;jNa+), который предварительно уравновешен буферным раствором цитрата натрия, то молекула аминокислоты (в кислом растворе) притягивается ионными силами к сульфогруппе смолы своей положительно заряженной аминогруппой. Таким образом, при различных значениях pH аминокислоты находятся в различ­ ных состояниях [89—90]:

Отношение количества аминокислоты, связанного с ионообменником, к ее количеству, оставшемуся в растворе, выражается коэффициентом распределения (К) данной аминокислоты. Этот коэффициент распределения помогает разделять различные ами­ нокислоты и зависит от боковых радикалов (R) аминокислот. Аминокислота с самым низким коэффициентом распределения продвигается вниз по колонке в токе буфера до тех пор, пока не придет в контакт со смолой, которая менее насыщена этой ами­ нокислотой; здесь она адсорбируется и устанавливается новый коэффициент распределения. Затем повой порцией буфера, не содержащей каких-либо аминокислот, освобождается аминокис­ лота со следующим, более низким, коэффициентом распределе­ ния, которая уносится вниз по колонке, пока вновь не установится

22 ГЛАВА 1

равновесие со смолой. Тот факт, что имеются различные коэффи­ циенты распределения, означает, что каждая аминокислота ми­ грирует вниз по колонке с различной скоростью.

Факторы, влияющие на разделение аминокислот, описаны в разд. 1.4. В некоторых случаях анионная форма смолы дает определенные преимущества, которые помогают в разделении аминокислот и пептидов благодаря их способности образовывать более прочные связи за счет ионизированных карбоксильных групп. Партридж [91] использовал анионообменную смолу для хроматографии аминокислот; в этих условиях аминокислоты и пептиды, несущие наименьший отрицательный заряд, связы­ ваются смолой в щелочной среде чрезвычайно слабо. Анионооб­ менные смолы нашли также применение для разделения ней­ тральных сахаров в виде боратных комплексов (Оме [92], Грин [93]); было также достигнуто разделение на одной анионообмен­ ной колонке смеси оснований, нуклеозидов и нуклеотидов [94].

Прежде чем тот или иной метод анионообменной хромато­ графии получит широкое применение, должен быть рассмотрен ряд вопросов, таких, как стабильность функциональных групп смолы, поперечное сшивание смолы или стабильность матрицы полимера, воспроизводимость партий смолы. Потеря стабиль­ ности активного участка влияет на результаты хроматографи­ ческого разделения двояким образом: во-первых, уменьшение числа теоретических тарелок ионообменной колонки [95] приво­ дит к изменению последовательности элюирования хроматогра­ фируемых зон; во-вторых, продукты разложения смолы являются во многих случаях нингидрин-положительными, что приводит к нестабильной фоновой линии (так называемые химические по­ мехи). Воспроизводимость смолы от партии к партии необхо­ дима для того, чтобы каждый разработанный и опубликованный хроматографический метод мог быть повторен без лишних уси­ лий, а не стал достоянием отдельных исследователей.

1.2.4.Хроматографические колонки

Обычно для хроматографических колонок используют калиб­ рованные толстостенные трубки из боросиликатного стекла. Ка­ либрованная изнутри стеклянная трубка необходима по следую­ щим причинам: а) при постоянной линейной скорости элюента предотвращается перемешивание зон аминокислот; б) опреде­ ленная спецификация позволяет изготавливать внутренние уп­ лотнения и другие детали колонки, например уплотняющие фитинги на концах колонки и фильтры для удержания смолы. Толстостенное стекло предотвращает поломки при рабочем дав­ лении, составляющем обычно 14—42 атм. Однако если тол­ щина стенок колонки слишком велика, то это может неблаго­

приятно сказываться на получении желаемого температурного градиента при смене температуры. Немаловажным является и состав стекла, который может создавать дополнительные труд­ ности в работе: а) повышение рабочего давления в результате взаимодействия стекла со смолой; б) нарушение разделения проб с небольшим содержанием аминокислот [96—97] вслед­ ствие так называемого «пристеночного эффекта» или связыва­ ния пробы со стенками стеклянной трубки. Что касается мето­ дов производства стекла, то его состав в настоящее время за­ висит от различных эмпирических факторов. Но поскольку из-за увеличения скорости буфера и сокращения времени анализа давление приближается к максимальному пределу, то нежела­ тельные эффекты, отмеченные при более низких рабочих давле­ ниях, не проявляются. В соответствии с вышеизложенным, для того чтобы уменьшить «пристеночный эффект», в современных методах используются преимущественно колонки диаметром 0,9 см, а не колонки с меньшим внутренним диаметром.

Калиброванные стеклянные трубки изготавливаются путем усадки некалиброванных трубок-заготовок вокруг калиброван­ ного стержня под действием нагревания и вакуума. Качество калиброванной трубки зависит от качества заготовки. Для изго­ товления колонок используют боросиликатное стекло, которое обладает достаточной химической стойкостью и которое благо­ даря низкому коэффициенту термического расширения устой­ чиво к резким изменениям температур. Для того чтобы указан­ ные свойства проявлялись в наибольшей степени, необходимо высокое содержание двуокиси кремния в сырье. Вследствие мно­ гих неконтролируемых процессов при производстве стеклянных колонок (незначительные изменения в составе сырья от партии к партии, а также в составе сырья, закупаемого у различных поставщиков) внутренняя поверхность колонок получается не­ одинаковой, что сказывается на взаимодействии смолы со стек­ лом.

1.2.5.Элюирующие жидкости

Для понимания функции буферов, используемых в хромато­ графии аминокислот, важно понять, что, по мере того как ами­ нокислоты, находящиеся в растворе на верху колонки, мигри­ руют вниз по смоле, на каждой теоретической тарелке или в каждой зоне колонки устанавливается равновесие. Разделение аминокислот, содержащихся в пробе, зависит от многих контро­ лируемых факторов, таких, как размер зерна ионообменной смолы, ее химическая природа и степень поперечной сшивки, диаметр колонки и высота столбика смолы, температура ко­ лонки, заряд и величина боковой цепочки аминокислоты, а

24 ГЛАВА 1

также ионная сила, величина pH и скорость течения элюирую­ щего буфера.

Скорость элюирования аминокислот и пептидов в значитель­ ной степени определяется составом и величиной pH буферов. Стейн и Мур [1] сообщили об использовании соляной кислоты увеличивающейся нормальности для элюирования аминокислот из колонки, заполненной смолой типа дауэкс-50 (сильнокислот­ ный сульфокатионит). В дальнейшем они установили, что бу­ ферные растворы цитрата и ацетата натрия имеют определен­ ные преимущества, поскольку при их использовании меньше раз­ рушаются и теряются лабильные аминокислоты, легче осущест­ вляется анализ вытекающего из колонки эффлюента с помощью нингидриновой реакции. Они показали также, что свойства элюента можно изменять добавлением органических раствори­ телей. Так, при добавлении к буферным растворам бензилового спирта в количестве 1 % пики ароматических аминокислот ста­ новятся более острыми. Пропиловый спирт ускоряет элюирова­ ние преимущественно таких аминокислот, которые имеют боль­ шие неполярные боковые цепочки [2].

Применение буферных растворов в жидкостной хроматогра­ фии на колонках требует рассмотрения ряда аспектов, которые обычно не обсуждаются при использовании буферов для других целей: а) чистота реагентов; б) молярная концентрация солей, включая соли, необходимые для получения буферной емкости; в) растворы, не содержащие газов; г) растворы, не содержащие плесневых грибов и спор; д) растворы, не содержащие коллои­ дов и пыли; е) определение Н-ионов с минимальным влиянием активности других катионов.

Поскольку через ионообменную смолу в колонке в течение длительного времени пропускается относительно большой объем буферных растворов, то на смоле адсорбируются некоторые ка­ тионы металлов, которые не элюируются при обычной процедуре регенерации смолы. Это приводит к постепенному уменьшению обменной емкости смолы. Однако первоначальная емкость смолы может быть восстановлена по специально предписанной мето­ дике. При хроматографии на анионообменных смолах некоторые комплексы металлов, обнаруживаемые в следовых количествах в-буферных растворах необратимо реагируют со смолой. Перво­ начальная емкость такого анионообменника не восстанавли­

вается.

Обычно при применении буферных растворов точная моляр­ ная концентрация солей не имеет решающего значения. Однако при элюировании аминокислот и пептидов из колонки, адсорби­ рующей катионы, очень важна концентрация катиона (кро­ ме Н+), поэтому требуется тщательная проверка концентрации катиона в буферных растворах. Важно также знать тип и кон­

центрацию противоиона (в данном случае анионов), поскольку при соответствующих рабочих диапазонах pH образуется целый

ряд слабых комплексов ионов с аминокислотами и пептидами. Плесневые грибы, споры и пыль, — все, что присутствует

в буферных растворах, может рассматриваться как загрязнение ионородными частичками. Такие примеси, подобно растворен­ ным газам, могут отфильтровываться на смоле и вызывать рост давления на колонке до такой степени, что она может разру­ шиться. На практике в буферные растворы добавляют ингиби­ торы роста плесени, такие, как каприловая кислота, пентахлорфенол или фенол. Однако было обнаружено, что при добавлении каприловой кислоты появляется неизвестный пик, который со­ впадает с пиком орнитина. Добавление фенола также вызывает появление пика, который повышает фоновую линию в области пары пиков глицин — аланин, анализируемых по методике для белковых гидролизатов. Для предотвращения роста плесневых грибов в бутыль с буфером можно поместить гермицидную УФ-лампу. Площадь неизвестного пика, о котором упоминалось выше, может со временем увеличиваться, что наводит на мысль о том, что, возможно, он обусловлен продуктом разложения каприловой кислоты. Уменьшить образование плесени и удалить другие загрязнения можно путем пропускания свежеприготов­ ленного буферного раствора через фильтр или сохраняя буферы на холоду. Количества реагентов, необходимых для приготовле­ ния таких специальных буферных растворов, приведены в разд. 1.6. Рекомендуемые методики представлены в табл. 2—6 (см. ниже).

При подборе оптимальных элюирующих буферов и их со­ става для хроматографии пептидов возникает ряд новых про­ блем, с которыми обычно не приходится сталкиваться при под­ боре буферных растворов для анализа аминокислот. Для хро­ матографии пептидов исследовались различные буферы [99— 100]. Вначале для анализа пептидов были использованы натрийцитратные или натрийацетатные буферы, описанные Муром и Стейном [2] для хроматографии аминокислот. В этом случае пептиды после их хроматографирования содержат соли. Пеп­ тиды можно также разделять, используя аммонийацетатные или аммонийформиатные буферы, которые удаляются сублимацией [98]. Для разделения пептидов применяли и летучие буферы: пиридин-ацетатные [101] для катионообменной смолы и пири- дин-коллидин-ацетатные [102] для анионобменной смолы. Со­ общалось, что нингидриновая реакция при использовании пири- дин-ацетатных буферов менее чувствительна, по-видимому, из-за

26 ГЛАВА Г

смешении с пиридин-ацетатным буфером; в результате pH смеси приближалось к 5, т. е. к значению, необходимому для опти­ мального развития окраски.

Чистота элюентов, особенно пиридин-ацетатных буферов, важна, когда требуется стабильная фоновая линия, поскольку элюенты могут содержать нингидрин-положительные соедине­ ния (возможно, первичные амины).

В дополнение к краткому описанию буферов для элюирова­ ния аминокислот и пептидов в разд. 1.4 будет уделено особое внимание различным факторам, которые необходимо учитывать при проведении хроматографического анализа. Важность этих факторов обусловлена тем, что условия хроматографии могут влиять на картину разделения аминокислот и пептидов.

1.2.6.Детекторы

Опубликовано много фотометрических методов, применяемых при определении аминокислот и пептидов с помощью хромато­ графии на колонках. Исследовано несколько колориметрических методов. Джейкобс [105, 106] сообщил об использовании стаби­ лизированного реагента индаметрионгидрата для определения аминокислот в пищевых продуктах; для стабилизации окрашен­ ного комплекса применялся 0,08%-ный раствор двухлористого олова. Опубликованы данные об использовании [3-нафтохинон- сульфоновой кислоты и нингидрина [107, 140]. Представляет ин­ терес сообщение об улучшенном кобальт-фенольном реагенте, дающем с аминокислотами и пептидами окраску с максимумом поглощения при 750 нм [108]. Емм и Кокинг [109] изучили реак­ цию аминокислот с нингидрином и установили, что для большин­ ства аминокислот может иметь место стехиометрическая реак­ ция с количественным выходом дикетогидриндилидендикетогидриндамина, который, возможно, является конечным продуктом реакции.

Широко, изучена реакция между а-аминокислотами и нин­ гидрином. Установлено, что окрашенные соединения образуются с аминокислотами, пептидами, белками и другими соединениями, имеющими свободные аминогруппы.

Нингидрин может быть использован для обнаружения кати­ онных комплексов никеля, кобальта и хрома [ПО]. Комплексы никеля и кобальта с этилендиамином дают с нингидрином более интенсивное окрашивание, чем их аммиачные комплексы. При анализе с помощью хроматографии на бумаге они дают окра­ шенные пятна, устойчивые в течение нескольких месяцев.

Руэман [111] показал, что при обработке в водной среде трикетогидринденгидрата (нингидрин) сероводородом обра­ зуется гидриндантин. Гидриндантин растворяется также в кар­

бонате натрия, образуя темно-красный раствор, и выпадает в осадок при добавлении разбавленной соляной кислоты.

Тролл и Каннан [112] установили, что органические раство­ рители— диоксан, этанол, метилцеллозольв, пиридин и фенол — ускоряют развитие окраски в различной степени. При комнат­ ной температуре теоретический выход дают десять из всех обыч­ ных аминокислот. При 100 °С все аминокислоты, за исключением триптофана и лизина, реагируют количественно. Фенол (80%) в абсолютном этаноле и KCN-пиридиновый реагент используются как наиболее эффективные растворители для нингидрин — гидриндантиновой реакционной смеси. Другие аномальные реакции нингидрина описаны Шиллингом с сотр. [113].

Обнаружено, что левулиновая кислота, элюирующаяся . вскоре после начала анализа, дает «нингидрин-положительный пик». Это еще раз доказывает, что нингидрин может быть ис­ пользован для обнаружения не только аминокислот, но и дру­ гих, не содержащих аминогрупп соединений, элюирующихся из колонки аминокислотного анализатора [114].

Захариус и Портер [115] обнаружили по нингидриновой ре­ акции неизвестный пик, который после соответствующего выде­ ления был идентифицирован как смесь фруктозы и глюкозы. Дальнейшие исследования показали, что имеется ряд углеводов и безазотистых соединений, которые дают при аминокислотном анализе нингидрин-положительные пики.

Другие модификации нингидринового реагента были опи­ саны Муром и Стейном [11]. По одной из модификаций исклю­ чается двухлористое олово, которое добавлялось для образова­ ния гидриндантина. В этом случае используют готовый гидриндантин, чтобы предотвратить возможность выпадения солей олова. Блакбурн [34] подробно обсудил химический состав нин­ гидринового и других реагентов на а-аминокислоты, образую­ щих окрашенный продукт (называемый фиолетовая Руэмана), и рассмотрел различные факторы, влияющие на стабильность нингидринового реагента.

При использовании гидриндантина для приготовления реа­ гентов могут возникнуть трудности, связанные с его низкой растворимостью и нестабильностью на воздухе [116]. Розен [117], Найт [118] и Томас с сотр. [119] описали стабильный и приемле­ мый для автоматических методов реагент, при приготовлении

сульфоксид (70:30). Для получения полностью растворимой смеси нингидрина и гидриндантина Мур [121] улучшил состав реагента, заменив метилцеллозольв дшуетилсульфоксидой и

28 ГЛАВА 1

используя литийацетатный буфер вместо натрийацетатного. Ин­ тенсивность окраски при использовании этого реагента на 1— 2% выше, чем те, которые получаются с реагентом, приготовлен­ ным на метнлцеллозольве и натрийацетатном буфере.

При соблюдении рекомендуемых предосторожностей нингидриновый реагент — наиболее чувствительный и воспроизводимый реагент для количественного анализа аминокислот и пептидов. При обычном режиме анализа буферированный нингидриновый реагент добавляется к жидкости, вытекающей из колонки, и затем смесь нагревается при. 100 °С в реакционной бане. Для того чтобы реакция доходила до конца и воспроизводилась, ре­ агент должен содержать минимальное количество гидриндантина, так как он нестабилен на воздухе и плохо растворим в метилцеллозольве. Кроме того, для обеспечения оптимальных ус­ ловий реагент должен быть защищен от света и тепла. Поэтому очень важно, чтобы к нингидриновому реагенту добавлялось точное количество двухлористого олова (которое используется в качестве агента, восстанавливающего эквимолярное количе­ ство нингидрина до гидриндантина). Атмосфера азота в буты­ лях защищает реагент от окисления.

Для количественного определения аминокислот и пептидов по приведенным выше реакциям требуется колориметр или фо­ тометр, с помощью которых обнаруживают изменения в светопоглощении, связанные с протеканием реакций. Поскольку пингидрин наиболее широко используется для обнаружения амино­ кислот и белков, он послужит основой для дальнейшего обсуждения колориметра.

Точные проточные колориметры не являются редкостью в ко­ личественном колориметрическом анализе. Однако примени­ тельно к хроматографии они должны соответствовать следую­ щим требованиям: а) длительная термическая стабильность компонентов; б) исключение утечки жидкости под давлением; в) минимальное перемешивание разделенных на колонке ве­ ществ, обеспечивающее минимальное взаимоналожеиие пиков; г) быстрое удаление пузырьков газа; д) легкость очистки кю­ веты от коллоидных осадков, мешающих прохождению света; е) легкость сборки.

Необходимость длительной термической стабильности коло­ риметра вызвана тем, что процесс снятия хроматограмм может длиться от 0,25 до 6 ч (по некоторым методикам даже 18 ч и более). За такое время нельзя добиться воспроизводимости и обеспечить должную точность ±2,5%, если колориметр не отве­ чает перечисленным выше требованиям. Герметичность кюветы важна для количественного анализа и для идентификации пиков по времени их выхода. Перемешивание потока жидкости в кю­ вете колориметра искажает форму пика. В том случае, когда

два или более пиков разделяются в минимально возможном объеме, перемешивание может нарушить степень разделения.

При реакции (100°С) нингидрин — гидриндантина и амино­ кислот образуется двуокись углерода [104]. При попадании пу­ зырьков этого газа в кювету может нарушиться световой поток. Поэтому пузырьки газа, образующиеся в результате химической реакции или по другим причинам, должны легко и быстро уда­ ляться. По той же причине необходимо удалять из кюветы и коллоидный осадок, образующийся из солей олова и, возможно, метилцеллозольва (см. обсуждение приготовления нингидринового реагента). Плотность таких коллоидных осадков в отличие от плотности пузырьков газа в некоторых случаях настолько высока, что поток буфера не может вымыть их из кюветы. По­ этому при конструировании кюветы всегда нужно учитывать возможность их загрязнения коллоидными осадками.

В случае загрязнения или закупорки кювету необходимо разобрать для чистки. Для облегчения этой простой операции конструкция кюветы должна предусматривать легкость сборки.

Кроме детекторов, предназначенных для количественного анализа аминокислот и пептидов по реакции с нингидрином или другими реагентами, дающими цветную реакцию, были описаны также и другие детекторы. Полярографическое определение ами­ нокислот в виде их медного комплекса основано на образовании из двух молекул аминокислоты и одного иона меди темно-синего комплекса. Этот комплекс пропускают через ячейку полярографа, где определяется количество меди [122]. Аминокислоты можно также определять путем использования динитрофторбензола с последующим фотометрическим определением ДНФ-ами- нокислот при 420 нм [123].

Хыоп и Байер [124] сконструировали детектор для жидкост­ ной хроматографии, который основан на изменении теплоты адсорбции (ДЯ) вещества на ионообменнике. После соответ­ ствующей калибровки он может быть использован для ко­ личественного анализа. Применение этого типа детектора не ограничивается анализом аминокислот или пептидов; его можно приспособить для анализа любых соединений, которые можно разделять, используя жидкостную хроматографию на колонках.

Усовершенствованием ДЯ-детектора является детектор, из­ меряющий осмотическое давление (АР) [125] при прохождении элюируемого вещества через ячейку. Подобно ДЯ-детектору эта система требует постоянства гидравлического давления и термостатирования. Чувствительность ДР-детектора в 3—5 раз выше, чем ДЯ-детектора.

Несмотря на то что АР- и ДЯ-детекторы имеют высокую чувствительность, оба они имеют общий недостаток, который

состоит в том, что они являются неспецифическими и поэтому могут затруднять идентификацию интересующих компонентов.

Усовершенствуют классические детекторы для нингидриновой реакции путем создания непульсирующего потока жидкости, уменьшения образования пузырьков газа и улучшения фотоэле­ ментов.

Андерсон с сотр. [126] описал хроматографическую систему с регулированием давления и с клапаном обратного давления после кювет детектора. Основываясь на усовершенствовании хроматографической системы, он предвидит возможность умень­ шения размеров и веса анализаторов аминокислот, улучшения хроматографического разделения за счет уменьшения переме­ шивания в реакторе, а также уменьшения соотношения величин шум — сигнал, что позволит усиливать сигнал. Авторы предпо­ лагают, что размеры жидкостных хроматографов будут умень­ шены с 2,7 до 0,014 м3 без потери точности или увеличения про­ должительности анализа.

1.2.7.Контроль температуры колонки

Кинетика обмена в ионообменной хроматографии амино­ кислот и пептидов сильно зависит от температуры. Воспроиз­ водимый контроль температуры колонки требуется для того, чтобы получить воспроизводимые последовательность и время выхода пиков, необходимые для идентификации аминокислот или пептидов и для разделения близких по свойствам соедине­ ний. Эти контролируемые условия обычно достигаются путем циркулирования воды из термостата по рубашке колонки. Тер­ мостат снабжается контрольным термометром. Емкость термо­ стата, мощность нагрева и скорость подачи воды насосом дол­ жны быть достаточными для поддержания температуры в рубашке колонки с точностью ±0,5 °С в диапазоне 30—70 °С. Од­ ной из тонкостей программирования температуры является ско­ рость повышения температуры при переходе от одной темпера­ туры к другой, как это предписывается многими методиками анализа. В тех случаях, когда по методике для данного прибора требуется смена температуры, которая происходит в течение 20 мин, любой другой температурный градиент может привести к нежелательным результатам. Поэтому неудивительно, что не­ которые методики не удается воспроизвести на сходных прибо­ рах, если режимы изменения температур не одинаковы. Целесо­ образно включать градиентное термостатирование в основную конструкцию анализатора.

1.2.8.Автоматизация

Автоматические анализаторы аминокислот относятся обычно к типу, который был разработан Опэкманом, Муром и Стейном