книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

ч

t; >

<—■— *— —

tj

Рис. 9. Вычисление времени пика воздуха по упрощенному методу Петер­ сона и Хирша [74, 75J.

<i. tt, времена удерживания трех гомологов, измеренные от момента ввода пробы, ij, t*, ig—приведенные времена удерживания трех гомологов, измеренные от пика

воздуха.

tm —время удерживания пика воздуха.

пробы. Однако при использовании пламенного детектора пик воздуха на хроматограмме не записывается, но может быть вы­ числен на основании гомологического ряда. Если данные пред­ ставлены с помощью индексов удерживания, то удобно исполь­ зовать гомологический ряд «-алканов для вычисления времени пика воздуха и индексов удерживания.

Рассмотрение сложных теоретических вопросов не является целью данной работы. Здесь обсуждаются только простейшие методы, использующие преимущества индексов удерживания для практической работы, потому что индексы удерживания мо­ гут быть очень полезными и в газохроматографическом анализе пептидов. По опыту автора этой главы только простейшие ме­ тоды имеют реальную возможность найти практическое приме­ нение; на этом основании изложение ограничивается главным образом графическими методами.

3.9.2.Вычисление времени пика воздуха

Вычисление времени пика воздуха основано на известном факте, что между логарифмом приведенного времени удержи­ вания и числом углеродных атомов в гомологическом ряду су­ ществует линейная зависимость. Из описанных в литературе

методов [74—76], использующих эту зависимость, будет рассмот­ рен только упрощенный метод Петерсона и Хирша [75] (см.

рис. 9).

На рис. 9 три пика представляют три гомолога, например три я-алкана, а максимум пика второго гомолога обозначен как условная точка нулевого отсчета, от которой измеряются рас­ стояния до пиков других гомологов Xi и хг. Приведенное время удерживания й второго гомолога вычисляется по формуле

_ х, • х2 2 х2 — х,

Время «пика воздуха» tm получается как разность времен удер­ живания h и приведенного времени удерживания второго гомолога

tm= ^2

По этим данным могут быть рассчитаны приведенные времена удерживания всех других пиков хроматограммы.

3.9.3.Определение индексов удерживания

3.9.3.1. Вычисление из изотермических хроматограмм

OcHQBHoe соотношение — это линейная зависимость между логарифмами приведенных времен удерживания членов гомоло­ гического ряда и числом их углеродных атомов. Для определе­ ния индексов удерживания нужно только построить полулога­ рифмический график, как показано на рис. 10. Здесь число углеродных атомов умножается на 100, а расстояние между н-алканами разделено на 100 единиц. Сначала на ординате в логарифмической шкале наносятся приведенные времена удер­ живания соответствующих к-алканов и строится калибровочная прямая н-алканов. Затем, как указано выше, вычисляют приве­ денное время удерживания t'x каждой из интересующих компо­ нент хроматограммы и находят индекс удерживания 1Х по кали­ бровочному графику, как показано на рис. 10.

3.9.3.2.Вычисление по хроматограммам

спрограммированием температуры

Вдействительности метод проще, чем расчет по изотермиче­ ским хроматограммам, так как в этом случае нет необходимости

даже в приведенных временах удерживания, а могут использо­ ваться сами времена удерживания или температуры удержива­ ния. Однако нужно иметь больше трех н-алканов для построе­ ния калибровочной зависимости, которая должна быть, кроме

186 Гл а в а з

того, и линейной в случае использования идеальной линейной температурной программы. Это означает, что программа начи­ нается с достаточно низкой температуры, но так как на практике начальная температура устанавливается в соответствии с раз­ делением первых компонентов хроматограммы, а не в соответ­ ствии с требованиями теории, обычно имеются некоторые поло­ жительные или отрицательные отклонения от линейной зависи­ мости.

Времена удерживания к-алканов из хроматограммы с про­ граммированием температуры наносятся в линейном масштабе против числа углеродных атомов. Число углеродных атомов и в этом случае умножается на 100, а каждое расстояние делится на 100 единиц. Проводится калибровочная линия, с помощью которой находят индекс удерживания 1Х компонента х, если ис­ пользуется время удерживания tx (см. рис. И).

Так как на практике неудобно смешивать исследуемый обра­ зец со стандартной смесью н-алканов, то соответствующие хро­ матограммы нужно записывать отдельно. Точность найденных таким образом индексов удерживания зависит в основном от воспроизводимости времен удерживания на соответствующем приборе в условиях программирования температуры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Gehrke С W„ Stalling D. L., Separ Sci., 2(1), 101 (1967); Gehrke C. W., Roach D., Zumwalt R. W., Stalling D. L., Wall L. L., Quantitative Gas

Liquid Chromatography of Amino Acids in Proteins and Biological Sub­ stances, Analytical Bio-Chemistry Laboratories, Columbia, Miss., 1968.

2.Stenhagen E., Z. Anal Chem., 181, 462 (1961).

3.Weygand F., Prox A., Konig W., Fessel H. H., Angew. Chem., 75, 724 (1963).

4.Weygand F., Prox A., Fessel H. H., Кип Sun K., Z. Naturforsch., 20b, 1169 (1965).

5.Prox А., Кип Sun К., Z. Naturforsch., 21b, 1028 (1966).

6.Prox A., Weygand F., in «Peptides», Ed. by H. C. Beyerman, A. van de Linde, and W. Maassen van den Brink, North-Holland Publishing Co., Amsterdam, 1967, p. 158. :

7.Weygand F., Z. Anal. Chem., 243, 2 (1968).

8.Lederer E., Das В. C., in «Peptides»,. Ed. by H. C. Beyerman, A. van de Linde, and W. Maassen van den Brink, North-Holland Publishing Co., Amsterdam, 1967, p. 131.

9.Shemyakin M. Af., Ovchinnikov У., Kiryushkin A. A., in «Peptides», Ed. by H. C. Beyerman, A. van de Linde, and W. Maassen van den Brink, NorthHolland Publishing Co., Amsterdam, 1967, p. 155.

10. Weygand F., Kolb B., Prox A., Tilak M. A., Tomida /., Hoppe Seylers,

Z. Physiol. Chem., 322, 38 (I960).

11.Biemann K-, Vetter W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 3, 587 (1961).

.12. Weygand F., in «Peptides», Ed. by H. C. Beyerman, A. van Linde, and

W.Maassen van den Brink, Pergamon Press, Oxford, 1965, p. 359.

13.Weygand F., Z. Anal. Chem., 205, 406 (1964).

14.Weygand F., Stegtich W., Z. Naturforsch., 14b, 472 (1959).

15.Fales Н М., Pisano J. in «Biomedical Applications of Gas Chromato­ graphy», Ed. by H. A. Szymanski, Plenum Publishing Corp., New York, 1964, p. 82.

16.Cruickshank P. Л., Sheehan I. C., Anal. Chem., 36, 1191 (1964).

17.Weygand F., Prox A., Jorgensen E. С., Axen R., Kirchner P., Z. Naturforsch., I8b, 93 (1963).

18.Bayer E., Koenig W. A., J. Chromatog. Sci., 7, 95 (1969).

23.Weygand £., Kolb B., Kirchner P., Z. Anal. Chem., 181, 396 (1961).

24.Tomida /., Tokuda T., Ohashi J., Nakajima M., J. Agricult. Chem. Soc.

27.Wehrli A., Kovats £., Helv. Chim. Acta, 42, 2709 (1959).

28.Etire L. S., Anal. Chem., 36(8), 31A (1964).

29; Wieland T., Lueben G., Ottenheym H., Faesel J., de Vries J. X., Konz W., Prox A., Schmid J., Angew. Chem., 80, 209 (1968).

30.Prox A., private communication.

31.Merrifield R. £., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963); 86, 304 (1964).

32.Gil-Av E., Feibush B., Charles-Sigler R., in «Gas Chromatography», Ed. by A. B. Luttlewood, Butterworths and Co., Ltd., London, 1966.

33.Weygand F., Konig W., Buyle R., Viehe H. G., Chem. Ber., 98, 3632 (1965).

34.Weygand F., Konig W., Z. Naturforsch., 20b, 710 (1965).

37.Charles R., Fischer G., Gil-Av £., Israel J. Chem., 1, 234 (1963).

38.Gil-Av £., Charles-Sigler R., Fischer G., Nurok D., J. Gas Chromatog., 4,

51(1966).

39.Gil-Av E., Charles R., Fischer G., J. Chromatog., 17, 408 (1965).

40.Pollock G. E., Frommhagen L. H., Anal. Biochem., 24, 18 (1968).

41.Pollock G. £., Oyama У. /., Johnson R. D., J. Gas. Chromatog., 3, 174 (1965) .

42.Pollock G. £., Oyama V. J., J. Gas Chromatog., 4, 126 (1966).

43.Halpern £., Westley J. W., Chem. Anal., 47, 589 (1965); Biochem. Biophys. Res. Commun., 19, 361 (1965); Tetrahedron Letters, 21, 2283 (1966); Chem. Commun., 2, 34 (1966).

44.Weygand £., Prox A., Konig W., Chem. Ber., 99, 1451 (1966).

45.Williams M. W., Young G. T., J. Chem. Soc., 1963, 881.

46. Anderson G W., Callahan F. M., J. Am. Chem. Soc., 80, 2902 (1958).

47.Clayton D. W., Farrington J. A., Kenner G. W., Turner J. M., J. Chem. Soc., 1957, 1398.

48.Bodanszky M., Nature, 175, 685 (1955); Bodanszky M., Szelke M., Tomorkeny £., Weisz £., Chem. Ind. (London), 1955, 1517.

49.Schwyzer R. et al, Helv. Chim Acta, 38, 69, 80, 83 (1955).

50.Weygand £., Swodenk W., Chem. Ber., 90, 639 (1960).

51.Weygand £., Steglich W., Chem. Ber., 93, 2983 (I960).

52.Weygand £., Steglich W., Angew. Chem., 73, 99, 757 (1961).

53.Sheehan 1. P., Hess G. P„ J. Am. Chem. Soc., 77, 1067 (1955).

54.Curtius Т„ Вег. Deut. Chem. Ges., 35, 3226 (1902); Harris J. /., Work T. S., Biochem. J., 48, 582 (1950); Nyman N. A., Herbst R. M., J. Org. Chem., 15, 108 (1950).

55.Anderson G. 117., Paul R., J. Am. Chem. Soc., 80, 4423 (1958); Paul R., Anderson G. W„ ibid., 82, 4596 (1960).

56.Goldschmidt S., Lautenschlager II.. Liebigs Ann. Chem., 580, 68 (1953);

Goldschmidt S., Gupta К. K., Chem. Ber., 98, 2831 (1965).

73, 1389, 3547, 5553 (1951).

58.Woodward R. B., Olofson R. A., Meyer H., J. Am. Chem. Soc., 83, 1010 (1961).

59.Wolma Y., Gallop P. M., Patchornik A., J. Am. Chem. Soc., 83, 1263 (1961); 84, 1889 (1962).

60.Beaumont S. M., Hanford B. O., Young G. T., Acta Chim. Acad. Sci. Hung., 44, 37 (1965); Beaumont S. M., Hanford B. O., Jones J. H., Young G. T.,

61.Jakubke H. D., Z. Naturforsch., 20b, 273 (1965).

62.Arens J. F., Rec. Trav. Chim., 74, 769 (1955).

63.Beyerman H. C., Maassen van den Brink W., Rec. Trav. Chim., 80, 1372 (1961).

64.Buyle R., Viehe H. G., Angew. Chem., 76, 572 (1964); Angew. Chem. In­

65.Sheehan J. C., Cruickshank P. A., Boshart G. L, J. Org. Chem., 26, 2525

(1961).

66.Bernhard S. A. et al., J. Am. Chem. Soc., 84, 2421 (1962).

67.Janak J., Nature, 185, 684 (1960).

Janak J., in «Gas Chromatography», Ed. by R. P. W. Scott., Butterworths and Co., Ltd, London, 1960, p. 387. Janak J., Collection Czech. Chem. Com­ mun., 25, 1780 (1960)

68.Ulehla J., Sb. Cesk. Akad. Zemedel. Ved., 7, 567 (1960).

69.Andrew T. D., Phillips C. S. C., Semiyen J. A., J. Gas Chromatog., 1, 27

(1963).

70.Winter L. N., Albro P. W., J. Gas Chromatog., 2, 1 (1964).

71.Stack M. V., Biochem. J., 96(3), 56P (1965).

72.Simon W., Giacobbo H., Angew. Chem., Intern. Ed., Engl., 4, 938 (1965).

73.Merritt C., Jr., Robertson D. H., J. Gas Chromatog., 5, 96 П967).

74.Ettre L. S. (ed.), Open Tubular Columns, Plenum Publishing Corp., New York, 1965.

75.Peterson M. L., Hirsch J., J. Lipid Res, 1, 132 (1959).

76.Gold H. J., Anal. Chem., 34, 174 (1962).

77.Andersson B. A., Acta Chem. Scand., 21, 2906 (1967).

78.Pollock G. E. Kawauchi A. H., Anal. Chem., 40, 1356 (1968).

79.Prox A., Schmid /., Ottenheym H., Liebigs Ann. Chem., 722, 179 (1969),

масс-спектрометрическим анализом полярные группы пептидов необходимо химически модифицировать.

4.2.1.Полиаминоспирты

Первое исследование по использованию масс-спектрометрии для определения аминокислотной последовательности было опу­ бликовано Бименом и сотр. [8]. Они предложили восстанавли­ вать пептидные связи и концевую карбоксильную группу литийалюминийгидридом для получения полиаминоспиртов, содержа­ щих диаминоэтановые остатки вместо амидных групп. Такие полиаминоспирты, полученные из коротких пептидов (не боль­ ших,. чем пентапептид), достаточно летучи и дают интерпрети­ руемые масс-спектры.

HZN—СН—СО—NH—СН—СО—NH—СН—COOH'd**”!*.

I

H2N-CH-^CH,-NH-CH-hCH,-M H-CH4CH,OH

В результате разрыва С—С-связей диаминоэтановых остат­ ков под действием электронного удара образуется серия ионов. Так, например, разрыв связей [см. схему I] по а, b или с приво­ дит к ионам с локализацией положительного заряда на любой части цепи. Однако фрагменты, содержащие положительный заряд на левой части, обычно устойчивее, так как заряд лока­ лизован на более замещенном углеродном атоме. Расщепление по d, е или / приводит к ионам, положительный заряд которых находится на углеродном атоме, где он стабилизирован соседним атомом азота. Полиаминоспирты почти не дают пика, соответ­ ствующего молекулярному весу, но вместо него наблюдается достаточно интенсивный пик М + 1. Рассматривая все эти пики, являющиеся наиболее интенсивными в спектре, а также учиты­ вая величину и характер различных R-групп, можно сделать вывод о структуре и природе пептида.

Пики в масс-спектрах полиаминоспиртов могут быть одно­ значно идентифицированы сравнением их с масс-спектрами со­ ответствующих дейтерированных производных, полученных вос­ становлением пептидов литийалюминийдейтеридом. Сравнение двух масс-спектров показывает, что пики сдвинуты в соответ­ ствии с тем, что каждая исходная карбонильная группа превра­ щается в СГ)2, а не в СН2.

Если полиамнноспирты содержат в боковых цепях гидро­ ксильные группы (образующиеся при восстановлении полифункциональных аминокислот, таких, как глутаминовая и аспараги­ новая кислоты, а также серина, треонина или оксипролина, остатки которых могут присутствовать в пептиде), необходима дополнительная модификация пептида. Авторы предложили за­ мещать гидроксильные группы хлором (путем обработки пеп­ тида тионилхлоридом) с последующим восстановлением LiAlH4 или LiAlD4. Относительная сложность химической обработки и наличие большого' числа пиков в масс-спектрах явилась причи­ ной того, что этот метод не нашел широкого применения.

4.2.2.Эфиры N-ацилолигопептидов

С усовершенствованием техники непосредственного ввода образца в ионный источник масс-спектрометра стало возможным исследовать производные пептидов с неизмененными пептид­ ными связями. Концевые амино- и карбоксильная группа пептида защищают посредством ацилирования и этерификации соот­ ветственно, что приводит к образованию эфиров N-ацильных производных пептидов, которые достаточно летучи для массспектрометрирования. Такое ацилирование и этерификация мо­ гут быть проведены с очень небольшим количеством вещества [9, 10]. Были исследованы метиловые [И], этиловые [12] и трет- бутиловые [13] эфиры в сочетании с различными N-защитными группировками производных пептидов, включая ацетильную [14], трифторацетильную [15, 16], гептафторбутирильную [17], бензилоЕссикарбонильную [18, 19], фталоильную [20], этоксикарбонильную [21], гексаноильную [22], 2,4-динитрофенильную [23], де­ каноильную [18] и стеароильную [18] группировки. Из перечис­ ленных производных проще всего получить метиловые эфиры Ы-ацетил(или трифторацетил) производных, которые вполне при­ годны для масс-спектрометрического исследования.

Масс-спектрометрическое изучение пептидов, содержащих функциональные группы в боковых цепях, затруднено вследствие их низкой летучести. Эти функциональные группы необходимо модифицировать перед масс-спектрометрированием. Аминогруп­ пы боковых цепей (лизин, орнитин) и карбоксильные группы (аспарагиновая и глутаминовая кислоты) модифицируются од­ новременно с концевыми группами в ходе методики ацилиро­ вания— этерификации. Спиртовые группы (серин, треонин и т. п.) можно превратить в их О-ацетильные производные [24] или, что еще лучше, метилировать [см. ниже). Тирозинсодержа­ щие пептиды дают удовлетворительные масс-спектры только после метилирования фенольного гидроксила [25]. Трудности, возникающие в случае "аргининсодёржащих пептидов, могут

быть решены (по крайней мере частично) превращением аргининового остатка в орнитиновый или 6-(2-пиримидил)орнитино- вый остатки [26,27], которые дают производные, достаточно ле­ тучие для масс-спектрометрирования.

4.3.ОСНОВНЫЕ ПУТИ ФРАГМЕНТАЦИИ ПЕПТИДОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Производные пептидов, имеющие структуру

Х-СО-.,. -NH-Ch4-c 4 nh4 cH—С-... СООСНз

могут претерпевать при масс-спектрометрировании разрыв ка­ кой-либо из 1-, 2- и иногда 5-связей с локализацией заряда на левой или правой части. Для определения аминокислотной по­ следовательности важны только те ионы, которые содержат N-концевую часть цепи, и они, как правило, встречаются наибо­ лее часто.

4.3.1.Фрагментация пептидной связи

Вмасс-спектрах производных N-ацилпептидов присутствуют пики, соответствующие разрыву пептидной связи

(. ..-NH-CH-C-fNH-CH-C-...)+ ----- ►

+

... -NH-CH-Cs О + ... -NH-CH-C-...

В высших олигопептидах эти пики, обусловленные ацилиумионами, часто являются наиболее интенсивными, и создается впечатление, что происходит последовательное отщепление од­ ного аминокислотного остатка за другим, начиная от молеку­ лярного иона. Метастабильные пики, по крайней мере отчасти, подтверждают такой распад [28]. Например, в фортуитине II (см. разд 4.4.1.1) последовательное отщепление остатка Val4 и Val3 подтверждается метастабильными пиками при mje 437,8 и

т/е 465,1 [29].