книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

оптически чистая и можно исключить дополнительную рацеми­ зацию на стадии пептидного синтеза. По этой причине Хальперн и Уэстли [43] использовали хлорангидрид N-ТФА-ь-пролина в качестве оптически активного N-ацилирующего агента: пролин не рацемизуется во время ацилирования или пептидного син­ теза, так как невозможно образование промежуточного оксазолона. Получающуюся при полном гидролизе смесь аминокислот сначала этерифицировали, затем ацилировали и образующиеся метиловые эфиры N-ТФА-ь-пролилпептидов разделяли с по­ мощью ГЖХ.

Аналогичным методом Проке и Вейганд [6] подтвердили ь-конфигурацию пролина в циклическом нонапептиде (см. разд. 3.5.1). После полного гидролиза полученные аминокислоты сначала трифторацетилировали и затем превращали в соответ­ ствующие метиловые эфиры N-ТФА-аминокислоты-ь-валина ре­ акцией с метиловым эфиром ь-валина в условиях, исключающих рацемизацию. С помощью ГЖХ удалось подтвердить ь-конфи­ гурацию пролина, но было обнаружено также существенное ко­ личество, около 10%, D-пролина, что объясняли исключительно длительным временем гидролиза, необходимым для полного рас­ щепления. Этот результат представляет общий интерес, показы­ вая, что все методы исследования оптической чистоты соедине­ ний, основанные на полном гидролизе соответствующего пеп­ тида, несовершенны вследствие рацемизации, протекающей в какой-то степени в ходе кислотного гидролиза. В гораздо боль­ шей мере можно ожидать рацемизации в условиях полного гид­ ролиза, чем в более мягких условиях частичного гидролиза. Та­ ким образом, последнему методу следует отдать предпочтение, хотя, как упоминалось выше, при необходимости рацемизация может быть компенсирована до определенного предела анало­ гичной обработкой соответствующей аминокислоты.

Как уже указывалось, конфигурацию одной аминокислоты в N-ТФА-дипептиде можно установить, если известна конфигу­ рация другой, при условии, что оба диастереомера разделяют методом ГЖХ. Так как в пептидном синтезе рацемизации под­ вержена только активированная N-концевая аминокислота [22, 44] и не следует ожидать рацемизации другой аминокислоты, то, как было показано Вейгандом и сотрудниками в ряде об­ ширных исследований, появляется возможность определения степени рацемизации с помощью ГЖХ.

Если половина дипептида является оптически чистой, тогда любая оптически активная примесь в другой половине приведет к двум разделяемым компонентам. Поэтому, начиная синтез дипептида с чистыми ь-аминокислотами, после определенной ра­ цемизации в ходе синтеза следует ожидать присутствия ьь- и DL-диастереомеров, но не их d d - и LD-энантиомеров.

174 ГЛАВА 3

Рацемизация является серьезной проблемой в пептидной хи­ мии, другую проблему представляет определение степени раце­ мизации в ходе пептидного синтеза. Недостатком всех использо­ вавшихся до настоящего времени методов была необходимость очистки исследуемых соединений перед проверкой их оптической чистоты. С другой стороны, чтобы получить достоверные резуль­ таты, в ходе очистки после синтеза любые фракционирования должны быть полностью исключены. Определенные трудности встречаются при измерении оптического вращения, так как нужно располагать чистыми соединениями и взвешивать их. Та же необходимость существует и в энзиматических методах, поскольку нужно избегать блокирования фермента примесями. Энзиматические методы вполне пригодны для исследования очи­ щенных пептидов, но из-за названных причин в меньшей степени хороши для исследования сырой реакционной смеси.

Таковы задачи, которые наилучшим образом могут быть ре­ шаемы методом ГЖХ, при этом для соответствующих исследо­ ваний разработаны подходящие методики. Реакционная смесь после пептидного синтеза может непосредственно использоваться для ГЖХ, далее если в ней содержатся растворители, непрореа­ гировавшие исходные вещества, а также дополнительные соеди­ нения, такие, как соли, основания и другие примеси. Все эти соединения или отделяются на колонке, или же, если они неле­ тучи, остаются в системе ввода газового хроматографа. Более того, все определения могут выполняться с высокой точностью на субмикрограммовом уровне. Таким образом, метод ГЖХ можно использовать для контролирования оптической чистоты конечного продукта в ходе синтетических реакций.

Вследствие всех этих причин ГЖХ-анализ более чувствите­ лен, прост и надежен, требует меньше времени и вещества и обладает большей гибкостью в решении различных задач, чем все другие методы, на которые распространяются вышеупомя­ нутые ограничения.

Другие методы основаны на синтезе определенных пептидов и измерении степени рацемизации поляриметрически (тест Янга) [45], или на взвешивании рацемата после его количественного выделения дробной перекристаллизацией (тест Андерсона) [46], или на разделении соответствующих диастереомеров противоточным распределением и измерением удельного вращения DL-фракции, если не достигается полное разделение (тест Кен-

- нера) [47].

Исключительное применение N-ТФА-метиловых эфиров в газохроматографическом методе вовсе не означает, что только эти производные могут использоваться в пептидном синтезе. После завершения синтеза другие защитные группы могут быть замещены на трифторацетильную без фракционирования и ра­

цемизации. Это возможно по крайней мере для широко исполь-. зуемой карбобензоксигруппы, которую можно отщепить, а затем заменить на трифторацетильную группу обработкой пептида трифторуксусной кислотой [14]. Однако не исключена возмож­ ность непосредственного использования для газохроматографи­ ческого анализа метиловых эфиров N-карбобензоксипепти-

дов [15].

При исследовании рацемизации в пептидном синтезе можно ограничиться синтезом характерных диили трипептидов, диа­ стереомеры которых хорошо разделяются на подходящей ко­ лонке. На такой модели возможно изучение всех параметров, влияющих на рацемизацию, при этом вычисление процента рацемизации основано на том, что сумма площадей обоих пиков в два раза больше процентного отношения площади DL-изомера [20, 22]. Было показано [22], что процентное отношение площадей

пиков обоих диастереомеров отвечает весовому процентному содержанию этих соединений, что и следовало ожидать для столь близких изомеров. Поэтому нет нужды учитывать факторы чувствительности и связанные с ними проблемы.

Вейгандом и сотр. [19, 20, 22, 33—36, 44] разработаны про­ стые тесты, нашедшие практическое применение в ряде обшир­ ных исследований. Опубликованные тесты касались всех аспек­ тов рацемизации: влияния метода синтеза, природы раствори­ теля, времени реакции, температуры, добавок солей и третичных оснований, а также влияния индуктивных и стерических эффек­ тов. В задачу данной работы не входит детальное рассмотрение этих исследований, поэтому результаты цитируются лишь в та­ кой мере, чтобы дать возможность заинтересованному читателю найти оригинальную литературу.

3.6.1.Дипептидный тест

Синтез ь-валил-ь-валина в виде метилового эфира N-карбо- бензоксиили N-трифторацетилпроизводного является подходя­ щей моделью для данного теста, так как стерические препят­ ствия со стороны объемных боковых групп уменьшают скорость реакции, что позволяет хорошо дифференцировать и оценить влияние различных факторов на рацемизацию. Диастереомеры хорошо разделяются на капиллярной колонке, где жидкой фа­ зой служит полифениловый эфир OS-138 или полипропиленгликоль (см. рис. 2). Перед газохроматографическим анализом за­ щитную карбобензоксигруппу обычно заменяют на трифтораце­ тильную, как упоминалось выше [14].

В ранних работах, посвященных этой проблеме [20, 22], с помощью указанного теста изучали следующие методы пептид­ ного синтеза: метод активированных эфиров (/г-нитрофениловый

/г-метоксибензилоксикарбонил) с H-L-Val-OBu1 (т/?ет-бутиловый эфир ь-валина). Образующийся трипептид подвергался частич­ ному гидролизу, а после превращения в соответствующие N-ТФА-метиловые эфиры дипептидное производное N-TFA-l- Phe-L-Val-OMe анализировалось на возможное содержание DL-изомера ГЖХ на капиллярной колонке с полифениловым эфиром OS-138 в качестве жидкой фазы.

По этой методике, которая теперь может показаться устарев­ шей в свете излагаемых ниже методов, Вейганд, Проке и Кениг [44] детально исследовали 16 различных методов пептидного синтеза. Не было найдено никакой рацемизации в методе N-ok- сипиперидиновых эфиров по Янгу [60] и в методе виниловых эфи­ ров [52], однако методы га-нитрофениловых эфиров [48] и азид­ ный [54] свободны от рацемизации только при отсутствии из­ бытка оснований. Лишь следы рацемизации обнаружены при использовании метода Якубке [61] с 8-оксихинолиновым эфиром и совсем не обнаружена рацемизация в методе тиофениловых эфиров в тетрагидрофуране. Большая или меньшая степень ра­ цемизации наблюдалась с этоксиацетиленом [62], карбонилдиимидазолом [55], карбонилдитриазолом [63] и дициклогексилкарбодиимидом [53] в качестве конденсирующих агентов, тогда как значительная рацемизация имела место при использовании фосфоразометода [56] и инаминов. Примерами инаминов служат (трег-бутилэтинил)-диметиламин [64] и водорастворимый диимид, хлоргидрат-1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида [65]. Со слабой рацемизацией сталкивались также в методах Вудворда [58], Патчорника [59] и в методе смешанных ангидри­ дов [57].

Было найдено, что в дициклогексилкарбодиимидном методе рацемизация отсутствует, если реакцию проводят при —20 °С в тетрагидрофуране или диметилформамиде с добавлением двух эквивалентов N-оксисукцинимида [35]. В случае инаминов нет рацемизации только при их использовании для синтеза эфиров бензилоксикарбонилдипептидов, тогда как значительная раце­ мизация обнаруживается в синтезе этим методом эфиров N-ТФА-дипептидов или в образовании связи N-бензилоксикар- бонилпептида с эфирами аминокислот или пептидов [33].

Бейерман, Вейганд и сотр. [36] исследовали тем же методом влияние некоторых бифункциональных катализаторов на раце­ мизацию в пептидном синтезе через аминолиз цианметиловых, /г-нитрофениловых, тиофениловых и виниловых эфиров. Наибо­ лее широко исследовавшийся 1,2,4-триазол не вызывал рацеми­ зации, но имидазол, рекомендовавшийся для ускорения пептид­ ного синтеза, в некоторых случаях приводил к рацемизации.

Впоследствии новый упрощенный вариант трипептидного теста был предложен Вейгандом, Хофманом и Проксом [19],

Можно исследовать влияние параметров реакции и типа боковой цепи в этом виде асимметрического синтеза.

Вейганд [12] обратил внимание на возможное применение подобного асимметрического синтеза для введения трития в «-по­ ложение N-концевой аминокислоты. Это происходит, когда со­ ответствующая DL-аминокислота реагирует с трифторуксусным ангидридом, в который добавлено некоторое количество меченой тритием воды. В результате обмена протона образуется меченый тритием псевдооксазолон. При реакции с оптически активным метиловым эфиром аминокислоты, например ь-конфигурации, псевдооксазолон дает соответствующее меченое тритием произ­ водное дипептида, которое затем может быть разделено с по­ мощью перекристаллизации или препаративной ГЖХ.

Метод ГЖХ использовали для изучения соотношения а-у-пеп- тидов, получающихся при расщеплении ангидрида N-ТФА-глут- аминовой кислоты метиловыми эфирами аминокислот. Обнару­ жено, что производные а-дипептидов имеют меньшие времена удерживания (см. табл. 1), чем упроизводные, что связывалось со сферической геометрией а-производных [17]. Аналогичным образом можно определить соотношение а- и р-пептидов, полу­ чающихся из ангидрида N-ТФА-аспарагиновой кислоты, а также измерить степень возможной рацемизации в этих реакциях [12].

Известно, что эфиры аспарагинпептидов претерпевают а : р трансформацию при омылении в щелочных условиях, при этом результаты ГЖХ, представленные Вейгандом [12], хорошо согла­ суются с данными Бернарда и сотр. [66]. В последней работе, основанной на измерении кинетики, показано протекание после­ довательных реакций, в том числе образование диастереомерных имидов, идентифицируемых методом ГЖХ.

3.8.АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ ПИРОЛИТИЧЕСКОЙ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Нелетучие органические соединения можно анализировать с помощью пиролитической газовой хроматографии, минуя таким образом стадию получения производных. При этом образцы под­ вергаются термической фрагментации в потоке инертного газа, а продукты реакции направляются сразу же на колонку для дальнейшего разделения. Фрагментацию проводят либо им­ пульсным пиролизом, когда образец находится в контакте с нитью, нагреваемой электрическим током, либо в пиролитиче­ ской трубке, через которую пропускают газ-носитель. Пиролити­ ческая газовая хроматография весьма полезна при условии, что продукты распада тесно связаны со структурой исходного сое­ динения.

пирограмма пептида получалась простым сложением характе­ ристических фрагментов соответствующих аминокислот. Это, однако, наталкивается на определенные трудности, так как отно­ сительные интенсивности пиков, характерных для каждой ами­ нокислоты и важных для отнесения, по-видимому, зависят от пептидной связи. Некоторые простые аминокислоты дают отно­ сительно легкие хроматограммы при пиролизе чистых соедине­ ний, тогда как другие аминокислоты, например аргинин [71], даюг не менее сложные хроматограммы, чем у белков.

Чтобы преодолеть трудности, вызываемые плохой воспроиз­ водимостью условий пиролиза, Симон и Жакоб [72] описали при­ бор, в котором тонкий, примерно мономолекулярный слой об­ разца в виде пленки наносится на ферромагнитный проводник. Пленка может быть за 20—40 мс нагрета до точно определяе­ мой температуры, отвечающей соответствующей точке Кюри. Опубликованы данные о фрагментации 28 аминокислот по этой методике [72], однако при анализе пептидов те же проблемы остались нерешенными. На рис. 8 сравниваются примеры фраг­ ментации дипептида пролилфенилаланина и смеси (1:1) натрие­ вых солей пролина и фенилаланина. Можно видеть, что относи­ тельные интенсивности характерных фрагментов заметно изме­ нились. По-видимому, в этих исследованиях больше сделано для самого метода пиролиза, чем для анализа пептидов.

Меррит и Робертсон [73] опубликовали результаты пиро­ лиза 17 аминокислот и 10 пептидов. Среди других часто встре­ чающихся фрагментов, таких, как двуокись углерода, ацетони­ трил, пропенилнитрил, получающихся из всех аминокислот, а также аммиака, метана и азота, можно было обнаружить уни­ кальные характеристические фрагменты каждой аминокислоты. Они перечислены в табл. 6 и должны быть полезны для целей

и при пиролизе пептидов.

Однако на образование этих характеристических фрагмен­ тов, получающихся в результате пиролиза чистых аминокислот, по-видимому, влияет также и природа пептидной связи, так как следующие пары изомерных дипептидов Ala-Gly и Gly-Ala, Gly-Leu и Leu-Gly давали различные фрагменты. Для других дипептидов, фрагменты которых приведены в табл. 7, отмеча-

лось согласие с результатами, найденными для чистых амино­ кислот (табл. 6). По-видимому, отклонения пиролиза пептидов по сравнению с пиролизом аминокислот зависят от положения аминокислоты в пептиде. Это свойство должно скорее запуты­ вать интерпретацию фрагментации при пиролизе пептидов, чем являться ценным способом определения некоторых аминокислот на концах пептидной последовательности, как предлагалось авторами. При распространении исследований на природные пептиды пиролиз кристаллического бычьего инсулина, например, приводил к ацетону из глицина, бензолу из фенилаланина, то­ луолу из тирозина, пирролу из пролина, пропилену из глутами­ новой. кислоты, сероокиси углерода и сероуглероду из серусодержащих аминокислот.

3.9.ДОПОЛНЕНИЕ

3.9.1.Определение данных удерживания

Все данные по удерживанию, относительные времена удер­ живания или индексы удерживания, найденные в изотермиче­ ских условиях, выводят из приведенного времени выдерживания, измеряемого от времени пика воздуха, а не от времени ввода