книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

заходить с экстраполяциями слишком далеко. Именно по этой причине приведенный выше пример может быть вовсе нехарак­ терным для точности вычислений. Тем не менее из-за большого числа возможных дипептидов метод вычисления величин удер­ живания на основании довольно ограниченного количества стан­ дартных соединений может представлять интерес; кроме того, есть вероятность существования подобной зависимости и в классе трипептидов, где она может иметь еще большее значение.

3.5.ПРИМЕНЕНИЕ ГЖХ ДЛЯ АНАЛИЗА

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ

С самого начала применения в анализе пептидов метода ГЖХ он использовался с целью установления их аминокислот­ ной последовательности. В первой работе Вейганда, Кольба, Прокса, Тилака и Томиды [10] этот подход был продемонстри­ рован на примере шести синтетических пептидов известного строения.

Анализ аминокислотной последовательности интересующего пептида методом ГЖХ базируется на частичном гидролизе (пред­ почтительно кислотном) в концентрированой соляной кислоте [10, 18] или 8,5 н. растворе хлористого водорода в абсолютном метаноле, проводящемся в запаянной ампуле при^0°С в тече­ ние 5—17 ч [6,29]. В ходе деградации получаются все аминокис­ лоты, а также возможные пептидные фрагменты от дипептидов до олигопептидов. Ясно, что они образуются не в одинаковых количествах, поскольку пептидные связи сильно отличаются по чувствительности к кислотному гидролизу. Если частичный гид-

•ролиз проводится в метанольном растворе хлористого водорода, продукты деградации получаются в виде хлоргидратов соответ­ ствующих эфиров; для дальнейшего хроматографического ана­ лиза они нуждаются только в трифторацетилировании.

Частичный гидролиз линейной пептидной цепи, например тетрапептида A-B-C-D, приводит, помимо исходного тетрапеп­ тида, к-следующим продуктам фрагментации: двум трипептидам А-В-С и B-C-D, трем дипептидам A-В, В-С и С-D и четырем аминокислотам А, В, С, D. Из соотношения один'тетрапептид, два трипептида и три дипептида в таком гипотетическом при­ мере можно заключить, что исследуемый пептид должен пред­ ставлять собой линейный тетрапептид. Последовательность со­ ставляющих его аминокислот можно установить с помощью идентифицированных дипептидов, так как концевые аминокис­ лоты исходного пептида встречаются в дипептидных фрагментах только один раз, соответственно на концевых аминоили кар­ боксильных группах. Все другие аминокислоты, а именно N-кои- цевые в одном дипептиде и С-концевые в другом, встречаются

1

Прибор марки «Perkln-Elmer Model 900»; колонка: 1.82 м . 3,3 мм из нержавеющей стали с 2 ДИ диметилснликона OV-1 на носителе хромосорб G, п. к.,—ДМХС с размером частиц 80—100 меш; газ-носнтбль гелий, скорость потока 30 мл/мнн; температура программи­ руется, как указано; детектор: ПИД.

I—L-Ala-L-Ala, 2—L-Val-L-Ala, 3— L-Leu-L-Val, 4— L-Val-L-.Ma-L.-Ala, 5 —L-Leu-L-Val-L-Ala,

б—L-Leu-L-V al-L-Ala-L-Ala,

дважды. Суммирование всех идентифицированных дипептидов с одновременным перекрыванием дает исходную аминокислотную последовательность. Это соотношение иллюстрируется (рис. 5) на примере частичного гидролизата тетерапептида, анализиро­ вавшего ГЖХ на набивной колонке с диметилсилнконовой жидкой фазой OV-1 и программированием температуры. Иден­ тификация на хроматограмме трех дипептидов позволяет под­ твердить исходную аминокислотную последовательность

L-Leu-L-Val L-Val-L-Ala

___________ L-Ala-L-Ala L-Leu-L-Val-b-Ala-L-Ala

Наряду с тремя дипептидами можно было с успехом проанали­ зировать два вероятных трипептида и даже исходный тетрапеп­ тид, а соответствующие производные аминокислот в выбранных условиях хроматографии скрыты под пиком растворителя.

Следующим примером является показанная на рис. 6 хро­ матограмма частичного гидролизата довольно простого трипеп­ тида L-Pro-Gly-L-Phe. Анализировались N-ТФА-метиловые эфиры трех аминокислот и двух возможных дипептидов. Иден­ тификация обоих дипептидов и в этом случае приводит к ами­ нокислотной последовательности исходного трипептида. На данном простейшем примере будут рассмотрены проблемы иден­ тификации в ГЖХ-анализе.

Если основываться только на данных аминокислотного ана­ лиза, то нужно учитывать все следующие возможности амино­ кислотной последовательности: Gly-L-Phe-ь-Рго, Gly-L-Pro-L-Phe,

ь-Phe-Gly-L-Pro, ь-Phe-L-Pro-Gly, ь-Pro-Gly-L-Phe и l-Р го-ь-

Phe-Gly. Этот простой пример прекрасно иллюстрирует громад­ ное число вероятных структур и проблемы идентификации в ГЖХ. Это происходит вследствие того, что дложны быть из­ вестны данные по удерживанию всех дипептидов, которые могли бы получиться из этих комбинаций, чтобы подтвердить, что в выбранных условиях хроматографирования все они успешно разделились бы. Идентификация правильна лишь в том случае, если могут быть исключены все остальные комбинации. Для по­ лучения необходимых данных по удерживанию можно обра­ титься к таблицам и проанализировать стандарт в тех же усло­ виях или же с известной осторожностью воспользоваться вы­ численными величинами. Очевидно, что любая дополнительная информация (например, знание концевой аминокислоты) значи­ тельно сокращает число вероятных последовательностей.

На практике, однако, не всегда достаточно только анализа дипептидов частичного гидролиза (особенно если одна или бо­ лее аминокислот встречаются в пептидной цепи несколько раз в

6

Рис. 6. Газохроматографическое разделение продуктов частичного гидро­ лизата трипептида L-Pro-Gly-L-Phe в виде N-'ТФА-метиловых эфиров.,'

/ —Шу, '2—Pro, 3 —Phe, 4—L-Pro-GIy, S—Gly-L-Phe.

различном положении), так как могут’оказаться недоступными достаточно перекрывающиеся фрагменты. В таком случае для идентификации должны использоваться трипептиды и даже тет­ рапептиды, чтобы охватить всю пептидную цепь перекрывающи­ мися фрагментами. Из-за большого числа пептидов этой группы данных по удерживанию уже недостаточно и возникает потреб­ ность в других методах идентификации. Если используется на­ бивная колонка, это может быть сделано путем улавливания соединений, выходящих с колонки, для последующего исследо­ вания. Удержанное соединение может быть снова подвергнуть

частичному гидролизу, а его аминокислотную последователь­ ность можно еще раз проверить с помощью ГЖХ или других хроматографических методов.

3.5.1.Анализ последовательности с помощью комбинации методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии

Наиболее обещающим подходом для дальнейшего исследо­ вания пептидов, разделенных методом ГЖХ, является массспектрометрия (см. гл. 4 и ср. с разд. 3.3.2), как указывалось в нескольких публикациях Вейгандом, Проксом и сотр. [3—7, 291.

мВ

/S—Phe-Val-IIe-Abu, 1 9 — Pro-Phe-Phe, 20—?

В настоящее время наибольшее значение в анализе последова­ тельности аминокислот приобрела комбинация методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГЖХ/МС); главным об­ разом это произошло благодаря достижениям масс-спектромет­ рии пептидов. Метод ГЖХ/МС исключительно успешно приме­ нялся для выяснения структуры нескольких природных пепти­ дов. Некоторые результаты будут обсуждаться на следующих страницах, дополняя таким обрзом гл. 4.

Проке и Вейганд [6] описали анализ последовательности гомодетного циклического нонапептида из семян льна с по­ мощью комбинированного метода. Пептидные фрагменты после частичного гидролиза в метаноле разделяли в виде, трифтораце-

тилметиловых эфиров на набивной силиконовой колонке с про­ граммированием температуры; при этом можно было разделить 20 пептидов, включая даже пентапептид. После улавливания в стеклянной трубке соединения затем идентифицировали массспектрометрически. На основании полученных результатов была выведена аминокислотная последовательность, показанная с по­ мощью идентифицированных перекрывающихся фрагментов.

L - V a l - L - P r o

L - V a l - L - P r o - L - P r o

L - V a l - L - P r o - L - P r o - L - P h e

L-Pro-L-Pro

L - P r o - L - P r o - L - P h e

L - P r o - L - P h e

L - P r o - L - P h e - L - P h e

L - P h e - L - P h e

L - P h e - L - P h e - L - L e u

L - P h e - L - L e u

L-Phe-L-Leu-L-IIe

L - L e u - L - I le

L - L e u - L - I le - L - I le

L - L e u - L - I le -L -I le -L -L e u

L - L e u - L - l l e - L - I l e - L - L e u - L - V a l

L - I le - L - I le

L - I l e - L - l l e - L - L e u

L - I l e - L - I l e - L - b e u - L - V a l

L - I le - L - L e u

L - I le -L -L e u -L -V a l

__ L - V a l - L - P r o - L - P r o - L - P h e - L - P h e - L - L e u - L - 1 le - L-I l e - L - L e u - j

В указанной работе столкнулись с определенными осложне­ ниями из-за того, что трудно было провести выбор между лей­ цином и изолейцином. Соответствующие лейциновые и изолейциновые пептиды не разделялись методом ГЖХ, и даже с по­ мощью масс-спектрометрии не во всех случаях можно было выполнить отнесение изомеров. Окончательный вывод оказался возможен при использовании капиллярной колонки для дальней­ шего разделения уловленных соединений. В настоящее время эти трудности, по-видимому, преодолены также и с помощью масс-спектрометрии [30].

Впоследствии Вейганд [7] сообщил об анализе последова­ тельности метионинсодержащего циклического нонапептида, ко­ торый был обнаружен как примесь в вышеупомянутом цикло­ пептиде. Перед частичным гидролизом пептид сначала десульфировали на никеле Ренея, так как в условиях частичного метанолиза соляной кислотой в метаноле метионин разлагается, и по этой причине метионинсодержащие пептиды отсутствуют на хроматограмме. После перевода в соответствующие производные с помощью ГЖХ можно было разделить 16 пептидов, как пока­ зано на рис. 7, и идентифицировать их масс-спектрометрически