книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

ными для разделения диастереомеров [20, 22]. Для более общего применения, включающего целый набор аминокислот и дипептидов, вышеупомянутые высокотемпературные силиконы могут быть полезны в работе с капиллярными колонками, особенно в режиме с программированием температуры, как это указано на рис. 1. Данный капилляр со смешанной жидкой фазой из диметилсиликона OV-101 и карбовакса 20М был изготовлен для лучшего разделения различных классов аминокислот, дипептидов и трипептидов. По имеющимся наблюдениям небольшое количе­ ство сильнополярного вещества (такого, как полигликоль), сме­ шанного с неполярной жидкой фазой (например, OV-101), при­ водит к увеличивающемуся сдвигу между классом дипептидов и трипептидами в сторону больших времен удерживания. Этот эффект особенно ценен в той части пептидной хроматограммы, где дипептиды смешаны с трипептидами, потому что группа трипептидов целиком может быть отделена от дипептидов для облегчения идентификации последних. Эффект можно обнару­ жить на приводимом (см. рис. 1) примере разделения амино­ кислоты фенилаланина и дипептида А1а-А1а; с чистым диметилсиликоном OV-101 дипептид элюировался бы перед упомянутой аминокислотой. Именно в этой области при неполярной жидкой фазе перекрываются аминокислоты и дипептиды. Вероятно, тот же эффект можно было получить с одним из высокотемператур­ ных силиконов умеренной полярности, однако для их примене­ ния требуются дальнейшие исследования. Хроматограмма на рис. 1 является демонстрацией возможных преимуществ стек­ лянной капиллярной колонки с высокотемпературной силико­ новой жидкой фазой и программированием температуры.

3.3.2.Детекторы

Для указанных целей достаточно использования обычных для ГЖХ детекторв, а именно пламенно-ионизационного детек­ тора (ПИД) и детектора с нагреваемой нитью (ДНН). ПИД применяется для малонагруженных набивных и капиллярных колонок из-за их низкой емкости, тогда как ДНН можно исполь­ зовать только для сильнонагруженных колонок. Электроноза­ хватный детектор (ЭЗД) не применялся для газохроматографи­ ческого анализа производных пептидов. В этом случае в отличие от производных аминокислот применение ЭЗД ограничено из-за неизбежно высокой температуры колонки и связанной с этим опасностью загрязнения детектора в результате утечки фазы с колонки, влияющей на интенсивность сигнала и чувствитель­ ность. Тем не менее гептафторбутирилпроизводные могли бы оказаться полезными вследствие их большей летучести и высо­ кого сродства к электрону.

/ —Met, 2—Phe, 3—Leu-Ala (LL + DL), 4—Val-Val (LL), 5—Val-Val (DL), 5—Рго-Val (LL), 7—Ala-Phe (LL), 3—Ala-Phe (DL), 9— Phe-Phe (LL), /0 —Phe-Phe (DL).

Самым универсальным детектором, no-видимому, является, масс-спектрометр, который может считаться детектором для ГЖХ, если колонка непосредственно соединена с масс-спектро­ метром при помощи молекулярного сепаратора (см. также разд. 3.5.1). На таком приборе газовая хроматограмма реги­ стрируется датчиком полного ионного тока, как показано на рис. 3, в то же время масс-спектр может сканироваться от каж­ дого интересующего пика. Однако из-за чрезмерной утечки жидкой фазы с колонки при повышенных температурах, дающей

в масс-спектре сильный фон, непосредственная комбинация ме­ тодов ограничивается исследованиями низших пептидов и в меньшей степени пригодна для изучения более длинных пепти­ дов при тех высоких температурах, которые необходимы для газохроматографического разделения. По этой причине метод улавливания соединений после колонки с целью дальнейшего масс-спектрометрического исследования кажется более удобным для высших пептидов, например три- и тетрапептидов. Недавно Байер и Кёниг [18] сообщили о применении комбинированного прибора газовый хроматограф — масс-спектрометр для разделе­ ния пептидных производных, но, вероятно, из-за обсуждавшихся выше трудностей приведенные масс-спектры сканировались с использованием системы прямого ввода прибора.

3.4.ПУБЛИКАЦИЯ ДАННЫХ

Данные по удерживанию должны быть представлены таким образом, чтобы их можно было пересчитывать для опытов с другими приборами и условиями. Можно получить абсолютные величины путем измерения коэффициентов распределения или удельного удерживаемого объема, однако для практических це­ лей данные удерживания приводят главным образом в относи­ тельном виде — либо измеряют удерживание по отношению к стандартному веществу, либо измеряют индексы удерживания по отношению к гомологическому ряду к-алканов (см. разд. 3.9).

3.4.1.Относительное время удерживания

Чтобы определить относительные времена удерживания в ряду соединений, нужно выбрать стандарт, время удерживания которого является приблизительно средним для данного ряда. Для возможности сравнения результатов разных лабораторий и во-избежание пересчетов следует в качестве стандарта исполь­ зовать одно и«то же вещество. К счастью, все имеющиеся в ли­ тературе относительные времена удерживания метиловых эфи­ ров N-ТФА-дипептидов даны по отношению к метиловому эфиру миристйновой кислоты; более того, все измерения проводились в сходных условиях на колонках с высоким содержанием сили­ конового масла.

Относительные времена удерживания метиловых эфиров N-ТФА-дипептидов измерены в лаборатории Вейганда [10, 17, 23], а также Томидой и сотр. [24]. Результаты собраны в табл. 1, 2 и 3. В табл. 1 относительные времена удерживания вычислены для колонок с диметилсиликоновой жидкой фазой, с тем отли­ чием, что некоторые величины вычислены на основании приве­ денного времени удерживания, измеренного по времени пика

Таблица 2

ОТНОСИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ ТРИМЕТИЛСИЛИЛЬНЫХ ЭФИРНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ N-ТФА-ДИПЕПТИДОВ НА АПИЕЗОНОВОИ СМАЗКЕ. (ОТНОСИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА МИРИСТИНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИНЯТО РАВНЫМ 1,00 [17])

Таблица 3

ОТНОСИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ ДИКЕТОПИПЕРАЗИНОВ НА ДИМЕТИЛСИЛИКОНОВОИ ЖИДКОЙ ФАЗЕ (ОТНОСИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА МИРИСТИНОВОЙ КИСЛОТЫ = 1,00 [17])

воздуха, тогда как другие рассчитаны на основании полного вре­ мени удерживания, измеряемого от момента ввода пробы. Имен­ но по этой причине цифры выше при низких значениях и ниже — при высоких, чем вычисленные на основании приведенных времен удерживания. Относительные времена удерживания всегда нуж­ но рассчитывать по приведенным временам удерживания, а если время пика воздуха нельзя измерить из-за использования пла­ менного детектора, его нужно рассчитывать (см. разд. 3.9). От­ клонения, однако, могут лежать в пределах точности измерений,

так как по ряду причин относительные времена удерживания, полученные в разных лабораториях, трудно воспроизвести. Эти характеристики сильно зависят от температуры, однако во мно­ гих продажных образцах приборов последнего поколения конст­ рукция печи недостаточно хороша в отношении градиентов тем­ пературы по колонке и точности записи температуры при ис­ пользовании термопар. Кроме температуры, на относительные времена удерживания могут влиять материалы колонки из-за различий в активностях носителей и химических свойствах жидкой фазы, не принадлежащей одной партии реагентов. Из­ вестно, что на относительное время удерживания полярного сое­ динения в некоторой степени могут оказывать влияние даже условия предыдущего использования колонки. С учетом этих ограничений рассмотрение данных табл. 1 свидетельствует об удовлетворительном соответствии значений, полученных в двух лабораториях.

Соединения табл. 1 перечисляются таким образом, что при постоянной N-концевой аминокислоте ак варьируется аминокис­ лота х с концевой карбоксильной группой, что дает ряды дипеп­ тидов ак-х. Сразу же можно заметить, что порядок С-коицевых аминокислот х одинаков для каждого ряда. Более того, в каж­ дом ряду сдвиг соединений характеризуется довольно постоян­ ным фактором. Это дает основание распространить систему от­ носительных времен удерживания на другие дипептиды, относи­ тельные времена удерживания которых еще не измерялись, при условии, что в качестве стандарта доступно по крайней мере по одному соединению каждого ряда. Вейганд, Кольб и Кирхнер

[23], а позднее также и Томида, Токуда, Охаши и Накаджима

[24]использовали для подобных расчетов соответствующий гра­ фик. Эта система, однако, проще объясняется с помощью индек­ сов удерживания и будет рассмотрена позже. В табл. 2 собраны некоторые триметилсилильные эфирные производные метиловых эфиров N-ТФА-дипептидов, разделявшихся с апиезоновой смаз­ кой в качестве жидкой фазы.

При комбинации двух аминокислот могут получиться не только дипептиды, но также и дикетопиперазины, которые тоже обнаруживались в частичных гидролизатах [6]. В результате воз­ никают трудности в анализе хроматограммы, так как дикетопи­ перазины выходят вместе с метиловыми эфирами N-ТФА-дипеп­ тидов. В табл. 3 приведены относительные времена удержива­ ния некоторых дикетопиперазинов, измеренные в условиях, со­ поставимых с условиями относительных времен удерживания метиловых эфиров N-ТФА-дипептидов в табл. 1.

Уэстли, Клоуз, Нитеки и Хальперн [25] сообщили о газохро­ матографическом разделении 13 дикетопиперазинов, которые, однако, не включены в табл. 3. Данные по удерживанию были

а Условия ГХ-апализа приведены в табл. 5.

порядок, что и точность измерения, составляющая около плюс — минус двух единиц.

Втабл. 5 суммированы индексы удерживания некоторых рядов метиловых эфиров N-ТФА-дипептидов, разделявшихся на той же стеклянной капиллярной колонке с DC-200. Хромато­ грамма синтетической смеси метиловых эфиров N-ТФА-дипепти­ дов, полученная на данной колонке, приведена на рис. 4.

Вряде случаев отнесения l l - и DL-изомеров проведены с

чистыми соединениями. Однако обычно отнесение делалось только на.основании сравнения площадей пиков, так как синтез соединений из исходных оптически чистых ь-аминокислот про­ водился в условиях, где можно было ожидать значительной ра­ цемизации и образования необходимого для сравнения DL-coe- динения. Если на колонке разделяют оба диастереомера, то обычно принимают, что меньший пик отвечает DL-соединению. Данный подход кажется вполне обоснованным, так как для из­ бежания перераспределения диастереомеров измерение проводят в реакционной смеси, не подвергавшейся предварительной очистке. Этим же объясняются появляющиеся на хроматограм­ мах синтетических смесей примеси, которые в дальнейшем не идентифицировали. Обычно ьь-изомеры метиловых эфиров N- ТФА-дипептидов элюируются раньше соответствующих DL-coe- динений, за исключением N-TFA-Ala-Ala-OMe и дипептидов с N-концевым пролином, где порядок элюирования обратный.

I______ 1________I________ Ц_______I________ 1

Рис. 4. Газохроматографическое разделение синтетической смеси N-ТФА- метиловых эфиров некоторых дипептидов.

Прибор марки «Perkln-EImer Fractometer F 20»; колонка: стеклянный капилляр 50м-0,25 мм,

Leu(LL), 7—Met-Val(LL), Д—Met-Val DL), S—Ala-Phe(LL), 10—Ala-Phe(DL), I t — Leu-Phe(LL), 12— Leu-Phe(DL).