книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

Г Л А В А 3

Газовая хроматография пептидов

Б. Кольб

3.1.ВВЕДЕНИЕ

Свведением газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в каче­ стве метода анализа аминокислот, пептидов и родственных сое­ динений значительно возросли возможности новых достижений в области пептидной химии. Значительные усилия были направ­ лены на развитие аминокислотного анализа методом ГЖХ, для чего исследовались различные типы производных. Однако в ко­ личественном анализе всем ГЖХ методам приходилось конку­ рировать с хорошо разработанными методами ионнообменной хроматографии, отличающимися высокой степенью автоматиза­ ции, точности и даже скорости анализа (например, метод лигандного анализа). По этой причине ГЖХ аминокислот в по­ следние годы нашла практическое применение в большей мере для некоторых специальных задач, где она могла даже превос­ ходить другие хроматографические методы, а не для количест­ венного определения аминокислот в сложных смесях. Однако теперь ГЖХ молено использовать в качестве дополнительного метода и для этой цели благодаря аналитическому подходу, раз­ работанному главным образом Герке и сотр. [1].

По сравнению с другими хроматографическими методами при анализе пептидов ГЖХ обладает рядом преимуществ, ко­ торые связаны с высокой разделяющей способностью и много­ численными возможностями метода, причем оба качества оказы­ ваются ценными и необходимыми, если учесть большое раз­ нообразие соединений в этой области. Одним из основных достоинств ГЖХ является то, что разделение основано на разли­ чиях в коэффициентах активности и давлении паров соответ­ ствующих соединений, т. е. соединения разделяются в соответ­ ствии не только с полярностью, но и температурами кипения. Тем не менее если с помощью ГЖХ (преимущественно с про­ граммированием температуры) анализируется сложная смесь многих соединений с широким диапазоном молекулярных весов, то элюирование происходит главным образом в порядке увели­

чения молекулярного веса. Химические свойства соединений мо­ гут изменять времена удерживания благодаря межмолекуляр­ ному взаимодействию с жидкой фазой лишь до определенного предела. Такую сложную смесь представляет собой, например, частичный гидролизат белка, содержащий соответствующие аминокислоты и полный набор всех возможных пептидов, полу­ чающихся в результате статистического расщепления пептидных связей. При использовании ГЖХ с программированием темпера­ туры можно пройти всю область от низших летучих аминокислот до дипептидов и высших пептидов, причем различные классы соединений элюируются в различных температурных интервалах с малым перекрыванием последних. Этим способом сложную смесь можно грубо разделить на различные классы соединений, начиная с группы аминокислот, за которой следуют дипептиды, смешанные с трипептидами и более длинными пептидами только на границе соответствующей им области. Ясно, что распределе­ ние соединений, осуществляемое ГЖХ на колонке с программи­ рованием температуры, должно обладать преимуществом перед другими хроматографическими методами, в которых соединения разделяются главным образом по химическим свойствам, в ре­ зультате чего на хроматограмме аминокислоты и пептиды на­ ходятся вместе.

На рис. 1 показано разделение синтетической смеси амино­ кислот и дипептидов в виде N-ТФА-метиловых эфиров на стек­ лянной капиллярной колонке с программированием темпера­ туры. При использовании данной колонки, изготовленной для специальных задач, можно видеть две отличающиеся области аминокислот (от аланина до фенилаланина) и дипептидов (от аланилаланина до фенилаланилфенилаланина). Ясно, что эта специфическая смесь содержит не все возможные аминокислоты и дипептиды.

Разделение сильно различающихся по составу соединений с программированием температуры не является единственной воз­ можностью применения ГЖХ — можно также осуществить сложное разделение изомеров, преимущественно в изотермиче­ ских условиях на высокоэффективных капиллярных колонках. На рис. 2 показано разделение на стеклянной капиллярной ко­ лонке с пропиленгликолевой жидкой фазой некоторых родствен­ ных диастереомерных метиловых эфиров N-ТФА-дипептидов, входящих в состав синтетической смеси. В данной смеси пред­ ставлены все возможные комбинации диастереомерных дипепти­ дов, полученных только из двух DL-аминокислот.

Одной из важнейших возможностей применения ГЖХ в ана­ лизе пептидов является ее сочетание с масс-спектрометрией для последующего анализа разделенных пептидов. Такая комбина­ ция ГЖХ и масс-спектрометрии служит мощным средством

Рис. 1. Газохроматографнческое разделение синтетической смеси N-ТФА- метиловых эфиров аминокислот и днпептидов.

современных исследований в этой области и оказывается необ­ ходимой, если предстоит анализ смеси неизвестных пептидов, что представляет собой, например, частичный гидролизат белка. В то время как идентификация аминокислот и дипептидов в принципе возможна путем измерения относительного удержива­ ния, индексов удерживания или же введением стандартов, эта процедура кажется неосуществимой для исследования высших пептидов из-за громадного числа вероятных соединений. Напри­ мер, если взять только 10 аминокислот, то их комбинация может привести к 100 дипептидам и 1000 трипептидам.

Использование масс-спектрометрии для анализа пептидов впервые предложено Штенхагеном [2], а позднее наиболее полно Вейгандом, Проксом и сотр. [3—7] на примере метиловых эфи­ ров N-ТФА-пептидов после того, как соединения разделяли р

50 м • 0.25 мм, подготовленный по Гробу |21] и покрытый полнпропнленглнколевой ж идкой

помощью ГЖХ и улавливали на выходе из колонки. Имеются также сообщения Ледерера [8] и Шемякина [9] о масс-спектро- метрин пептидов, но, так как масс-спектрометрическим аспектам посвящена гл. 4 этой книги, здесь, они больше обсуждаться не будут.

Газохроматографический анализ производных пептидов впер­ вые описан в 1960 г. в работе Вейганда, Кольба, Прокса и Томиды [10]. Эти авторы несколькими опытами продемонстриро­ вали главные задачи, все еще остающиеся актуальными, —

разделение диастереомеров, важное для изучения рацемизации, и анализ частичных гидролизатов с целью установления после­ довательности. О роли масс-спектрометрии в дальнейшей иден­ тификации улавливаемых соединений уже говорилось.

Впоследствии в ряде исследований метод ГЖХ получил бо­ лее широкое применение в этой области. Помимо ряда специ­ альных случаев они касались применения ГЖХ для выяснения аминокислотной последовательности в некоторых пептидах и исследования рацемизации в пептидном синтезе. Рассмотрим теперь эти вопросы более подробно.

3.2.ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕТУЧИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Так как свободные аминокислоты и пептиды недостаточно летучи, прежде чем начинать ГЖХ, их нужно превратить в летучие производные. Получение производных — это главная проблема, которая решена до сих пор еще не для всех пептидов. Часть трудностей возникает из-за того, что многие важные ами­ нокислоты в пептидной цепи наряду с а-амино- и карбоксиль­ ными группами содержат ряд других функциональных групп. В результате получаются производные, сильно различающиеся по летучести; кроме того, часто протекают осложняющие побоч­ ные реакции. Так как нет принципиальных отличий в методах получения летучих производных аминокислот и пептидов, можно ожидать, что результаты и опыт работы с производными амино­ кислот будут способствовать развитию аналогичных методов и для соответствующих пептидов. Пока недоступными для ГЖХ анализа являются пептиды, содержащие гистидин, аргинин или аминокислоты (подобно аспарагину и глутамину) с дополни­ тельной функциональной амидной группой. В отличие от амино­ кислот при анализе пептидов исследователь встречается с осо­ быми' эффектами, вызываемыми более высокими молекулярными весами пептидов и связанной с этим пониженной летучестью. Чтобы компенсировать низкую летучесть, приходится пользо­ ваться только такими защитными группами, которые очень устойчивы при высоких температурах, значительно увеличивают летучесть и легко доступны. Эти условия ограничивают приме­ нимость к пептидам большого числа защитных групп, исполь­ зуемых для аминокислот.

Биман и Веттер [11] разделили методом ГЖХ аминоспирты, образующиеся при восстановлении этиловых эфиров N-ацилпеп- тидов литийалюмогидридом. Для идентификации они исполь­ зовали масс-спектрометршо, однако сообщения о дальнейшем применении этого метода отсутствуют,

3.2.1.Защита аминогруппы

По нескольким причинам для защиты аминогруппы в ГЖХ использовалась, за редким исключением, трифторацетильная группа. Трифторацетильные производные эфиров аминокислот и пептидов очень устойчивы при высоких температурах, а три­ фторацетильная группа придает большую летучесть, чем любая другая замещенная ацетильная группа [12]. Только гептафторбутирильные производные имеют более высокую летучесть [13], но они не нашли пока широкого применения, хотя в сочетании с масс-спектрометрией [77] и кажутся привлекательными из-за того, что соответствующие производные эфиров пептидов можно разделять при меньших температурах колонки и меньшей утечке колонки.

Так как для ГЖХ-анализа необходимо большое количество стандартных соединений, которые, как правило, нельзя купить и нужно синтезировать, то следующее важное преимущество трифторацетильной группы состоит в том, что это обычно ис­ пользуемая защитная группа в пептидной химии. Если трифтор­ ацетильная защитная группа применена для синтеза, то обра­ зующиеся метиловые эфиры можно непосредственно использо­ вать в качестве пептидов-стандартов для газохроматографиче­ ского анализа. Если в синтезе применяется хорошо известная карбобензоксигруппа, ее следует заменить на трифторацетильную действием трифторуксусиой кислоты [14], хотя даже мети­ ловые эфиры карбобензоксидипептидов пригодны для ГЖХ [15]. Интерес могли бы представлять и некоторые другие производ­ ные, но так как до настоящего времени в достаточной степени исследовали лишь N-ТФА-производные пептидов, они и буцут рассматриваться в этой главе. Трифторацетилирование проводят или метиловым эфиром трифторуксусиой кислоты с триэтиламином в слабощелочном растворе [10], или трифторуксусным ангид­ ридом [16]. В этих же условиях вместе с а-аминогруппой трифторацетилированию подвергается вторая аминогруппа в боко­ вой цепи лизина и орнитина.

3.2.2.Защита карбоксильной группы

До сих пор для пептидов использовались исключительно ме­ тиловые эфиры. Этерифицируют обычно или перед ацилирова­ нием, в абсолютном метаноле с сухим газообразным НС1, что приводит к образованию хлоргидратов метиловых эфиров соот­ ветствующих пептидов, или же после ацилирования — с помощью диазометана. Если соединение содержит дополнительные кар­ боксильные группы, как, например, глутаминовая или аспараги­ новая кислоты, то они хорошо метилируются в тех же условиях.

Хлоргидраты метиловых эфиров образуются непосредственно при частичном гидролизе пептида, если он проводится в метанольном растворе хлористого водорода.

3.2.3.Защитные группы для третьей функциональной группировки

Если исследуемый пептид содержит аминокислоты с третьей функциональной группой, то простых производных — метиловых эфиров N-ТФА-пептидов — оказывается недостаточно.

Метиловые эфиры N-ТФА-пептидов с гидроксилсодержащими аминокислотами (такими, как серин, треонин или оксипролин) лучше всего превращаются в триметилсмлильные (ТМС) произ­ водные при кипячении с гексаметилдисилазаном в течение при­ близительно 20 мин [17]. Без силилирования наблюдались мно­ гочисленные пики, обусловленные разложением. Метиловые эфиры N-ТФА-пептидов, содержащих тирозин, дают асимметрич­ ные пики [17], возможно, из-за сильных водородных связей фе­ нольной оксигруппы. Несмотря на то, что эта проблема может быть решена метилированием диазометаном, силилирование и в этом случае является предпочтительным. Серин- и треонинсо­ держащие пептиды нужно силилировать в любом случае, а ти­ розин в соответствующих пептидах силилируется в тех же усло­ виях.

Определенные трудности встречались при работе с цистеин­ содержащими пептидами, так как они разлагаются в условиях, обычных для ГЖХ-аиализа. По этой причине свободная меркаптогруппа должна быть защищена, чтобы избежать р-элиминиро- вания, а также окисления до дисульфидной связи. Байер и Кё­ ниг [18] применили с этой целью S-бензильпую группу и описали ГЖХ анализ эфиров некоторых N-ТФА-дипептидов и трипептндов. Исследуемый пептид бензилировали перед частичным гид­ ролизом, который проводили концентрированной соляной кисло­ той при 37°С в течение 72 ч. После упаривания в вакууме, эте­ рификации диазометаном и трифторацетилировання проводили анализ с помощью ГЖХ и масс-спектрометрии.

Вейганд и сотр. [17] предлагали проводить десульфирование путем нагревания пептидов с никелем Ренея в 90%-ном мета­ ноле, в результате чего из каждого остатка цистеина образуются производные аланина. Все другие серусодержащме аминокис­ лоты также претерпевают элиминирование серы; метионин, на­ пример, превращается в а-аминомасляную кислоту. Другим примером из работы Вейганда и сотр. [17] является определение последовательности глутатиона. Тетраэтиловый эфир дисуль­ фида ди-И-ТФА-глутатиона сначала десульфировали, а затем после частичного гидролиза, метилирования и трифторацетили-

рования образующиеся метиловые эфиры N-ТФА-дипептидов ь-Glu-y-L-Ala и ь-Ala-Gly идентифицировали методом ГЖХ. Эти пептиды получались из последовательности L-Glu-y-L-Ala-Gly, доказывая таким образом первоначальную последовательность

L-Glu-y-L-Cys-Gly.

Вейганд и сотр. [17] обратились к использованию дейтерированного метанола для реакции десульфирования, чтобы с по­ мощью масс-спектрометрии после газохроматографического ана­ лиза решить, получается ли аланинсодержащий пептид из соот­ ветствующего цистеинсодержащего пептида. Впоследствии [7] эта методика была использована для выяснения аминокислотной последовательности в метионинсодержащем циклическом нона- г.ептиде. Пептидные фрагменты, получающиеся в результате частичного гидролиза, содержали соответственно а-аминомасля- ную (Abu) кислоту вместо метионина и после перевода в про­ изводные успешно идентифицировались комбинированием ГЖХ и масс-спектрометрии (см. рис. 7).

Следует упомянуть, что те же трудности встретились в ГЖХ соответствующих аминокислот с окси- и сульфгидрильными группами, которые (согласно Герке [1]) могут успешно анализи­ роваться с помощью ГЖХ в виде ди-ТФА-производных. Однако из-за того, что трифторацетильная группа легко отщепляется от этих группировок в присутствии влаги или даже следов спирта в растворителях, пробы нужно вводить в растворе трифторуксусного ангидрида. Для обычной работы методика кажется ме­ нее привлекательной, так как при повышенных температурах ангидрид будет атаковать жидкую фазу колонки.

3.3.АППАРАТУРА

3.3.1.Колонки

Вначальном периоде развития метода ГЖХ для анализа пептидов было вполне достаточно обычных колонок с высоким

содержанием набивки, так как исследователи имели дело только с метиловыми эфирами N-ТФА-дипептидов, которые до­ статочно летучи и позволяют проводить анализ на таких колон­ ках в разумное время. Однако для дипептидов с высоким моле­ кулярным весом приходилось мириться с очень большими временами удерживания. Все имеющиеся в литературе данные по удерживанию были рассчитаны для. таких сильно нагружен­ ных колонок (см. табл. 1) с изотермическим режимом. Газохро­ матографический анализ полного ряда пептидов, от низкомоле­ кулярных дипептидов и даже аминокислот до высокомолекуляр­ ных олигопептидов, проводится преимущественно в мало загру­ женных колонках с 1—5% жидкой фазы на силанизированном