книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

122 Глава 2

[118]. С повышением содержания жидкой фазы разделение ци­ стеина и метионина улучшалось, тогда как в парах глицин — изолейцин, пролин—треонин и фенилаланин — аспарагиновая кислота пики сливались. Оптимальным признано покрытие

0,65%.

ДЭГС — единственная полиэфирная фаза, испытывавшаяся авторами главы для ГХ метиловых, этиловых и м-пропиловых эфиров ацетиламинокислот — не обеспечивала адекватного раз­ деления (рис. 3).

2.4.7.5.Полигликоли

Имеются отдельные сообщения о ГХ ТФА-аминокислот на карбоваксах (1% 20 М и 1540 на капиллярных колонках с дн- атопортом-S [56]) [57]. Авторы утверждают, что получили пики «трудных» аминокислот, включая аргинин и гистидин, и что между количеством пробы и интенсивностью сигнала имеется линейная зависимость [56]. Большие времена удерживания се­ рина и окснпролина могут свидетельствовать о деацилирова­ нии; об этом же говорят крайне слабые пики серина и треонина при элюировании с капиллярных колонок [57]. н-Амиловые эфи­ ры ТФА-цистеина, оксипролина [13], серина и треонина [27] не выходили с колонок с силоцелем С-22, покрытых 5% ПЭГ.

По нашим данным, н-пропиловые эфиры ТФА-треонина и серина разрушаются на колонках с 0,7% ПЭГ-6М на хромосорбе W (в. к.). Более высокая устойчивость эфиров ацегиламинокнслот позволяет проводить на полнгликолях газохрома­ тографическое разделение всех обычных аминокислот белковых гидролизатов, за исключением аргинина и гистидина [23, 52, 78, 113]. Разделение метиловых, этиловых и н-пропиловых эфи­ ров ацетиламинокислот на 0,7% ПЭГ-6М и 0,05% ТЦЭПЭ представлено на рис. 4 и 5.

2.4.7.6. Смешанные неподвижные фазы

В -случае когда одна жидкая фаза не обеспечивает необхо­ димого разделения смеси, можно прийти к компромиссному ре­ шению, смешав две жидкие фазы вместе. Такое же разделение достигается, если носители, каждый из которых покрыт одной жидкой фазой, смешиваются в соответствующих пропорциях или набиваются в колонки последовательно [23, 29, 41]. Во всех случаях разделение является средним для двух фаз. Мы иногда наблюдали относительные сдвиги пиков N-ацетил-н-пропило- вых эфиров изолейцина, лейцина и глицина на хромосорбе G или W (в. к.) с идентичной пропиткой жидкой фазой. На рис. 6 представлены два крайних случая: разделение пар

Температ ура, °С

N--------------------- 6°С /м ин--------

Рис. 4. Разделение метиловых (Л), этиловых (Б) и к-пропиловых (В) эфи­ ров N-ацетиламинокислот на полигликолевой жидкой фазе.

Прибор фирмы cPerkln-Elmer, mode! 881». Колонка сдвоенная, стеклянная, аналитиче­ ская, со стандартными размерами 106 см ♦3 мм в. д. 0,796 ПЭГ 6М и 0,0596 ТЦЭПЭ на хромосорбе-W (и. к.) с размером частиц 100/120 меш; газ-носитель азот, скорость потока

Рис. 6. Относительные сдвиги пиков, наблюдаемые на различных партиях одинаково пропитанной насадки (колонки стандартные, см. рис. 4).

глицин — лейцин (А) и лейцин — изолейцин (Б). При смешива­ нии достигается компромиссное адекватное разделение всех трех пиков (см. также разд. 2.7.2).

2.4.7.7.Взаимодействие между носителем, жидкой фазой и производными и его влияние на разделение

Часто полагают, будто в газожидкостной хроматографии распределение между газовой и жидкой фазами зависит только от летучести вещества и его растворимости в - жидкой, фазе, однако уже с самых первых работ (1952 г.) [71] стало ясно, что важную роль играют водородные связи между растворителем и растворенным веществом. Сравнивая поведение первичных, вторичных и третичных аминов на парафинах и луброле-МО (продукт конденсации окиси полиэтилена и длинноцепочечного спирта), Джеймс и Мартин обнаружили корреляцию между удерживаемым объемом и способностью образовывать водород­ ные связи. Чтобы объяснить большее удерживание триметил-. амина на луброле, высказано предположение о том, что ме­ тальные группы имеют достаточную «активность» для образо­ вания водородных связей. Этого влияния не наблюдалось для Высших гомологов (сравни глицин). По мнению авторов, ана­ логичные взаимодействия имеют место между жидкой фазой и носителем, а также носителем и разделяемыми веществами. Поэтому на протяжении всей главы авторы решили употреб­ лять общий термин «газовая хроматография» (ГХ),' а не «га­ зожидкостная хроматография» (ГЖХ) — при использовании последнего подразумевается, что хроматография в системе газ — твердое вещество протекает по совершенно иным механизмам.

фазы [27]. На неполярных жидких фазах глицин обычно элюи­ руется раньше, (б) Серин и треонин элюируются в обратном порядке по отношению к их молекулярным весам, а различие во временах удерживания и положении пиков относительно лейцина является функцией полярности жидкой фазы [27]. Со­ гласно такому представлению о функциях жидкой фазы нельзя рассчитывать на хорошее разделение изолейцина и лейцина на инертной фазе и использование полярных фаз неизбежно; влия­ ние полярности на разделение останется невыясненным до тех пор, пока не будут «объяснены» все возможные участки свя­ зывания.

2.4.8.Количественное определение н-пропиловых эфиров ацетиламинокислог

Этерификацию можно контролировать с помощью тонко* слойной хроматографии, так как отсутствие реакции с нингидрином указывает на ацилирование ос-аминогруппы. Будучи по­ лезной на первом этапе исследования, методика, однако, не является удовлетворительной для определения процента пре­ вращения малых количеств аминокислоты. Сравнение площа­ дей пиков в ГХ аминокислот, прошедших все микроколичественные синтетические операции, с пиками высокоочищенных стандартных образцов позволяет провести точную количествен* ную оценку методики получения соответствующих произвол* ных [41, 84]. Намного труднее поставить опыты для доказа­ тельства того, что вещество устойчиво на колонке, а площадь регистрируемого пика действительно отвечает известному ко­ личеству аминокислоты. Большинство исследователей доволь­ ствовалось предположением, что пик правильной формы изме­ ряет все количество аминокислоты, нанесенной на колонку. Частичное решение этой проблемы было предложено Блау [11], рекомендовавшим сравнивать площади пиков, полученных на выбранной фазе и на очень неполярных фазах (SE-30). Для того чтобы компенсировать потери, связанные с обработкой или различными условиями ввода пробы, необходимо включать внутренний стандарт. В пламенно-ионизационных детекторах молярная интенсивность сигналов для всех аминокислот раз­ лична, но линейность интенсивности сигнала в нормальных ра­ бочих пределах позволяет проводить количественное измерение неизвестных соединений, поэтому между ними существует пря­ мо пропорциональная зависимость. Для вычисления молярных соотношений (например, в пептидном гидролизате) внутренний стандарт не требуется. Его нужно включать в одинаковой кон­ центрации в стандартную анализируемую смесь в том случае, если нужно рассчитать абсолютное количество каждой амино­ кислоты (см. разд. «обсуждение» в работе [41]),

2.4.8.1.Синтез стандартных образцов к-пропиловых эфиров ацетиламинокислот

В лаборатории авторов было синтезировано большое ко­ личество ацетил-н-пропильных производных всех обычных ами­

этилацетата остающийся сироп перегоняли, где это было воз­ можно, под вакуумом в специальном приборе с охлаждаемым «пальцем» (рис. 7). Треонин, орнитин, лизин и гистидин перекристаллизовывали из смеси петролейного эфира (т. кип. 100— 120 °С) с этилацетатом. Чистота проверялась методами ПК, элементного анализа и ЯМР. Производное гистидина было полу­ чено лишь с низким выходом (< Ю%), причем интегрирование ЯМР-спектра говорило о смеси моно- и диацетилированных

каптоэтанола, который элюируется обычно между треонином и серином.

модели CRS-100. Выходы всех аминокислот, которые можно было хроматографировать на этих колонках, лежали между 96% (лизин) и 102%. Как уже отмечалось, аргинин и гистидин превращали количественно в орннтин и аспарагиновую кислоту соответственно, а цистин восстанавливали и карбоксиметилировали.

2.4.9.ГХ-анализ белковых и пептидных гидролизатов

Существует значительный разрыв между числом статей, опи­ сывающих газохроматографические методы, и числом работ, посвященных приложению этих методов. Качественные анализы или же анализы, ограничивающиеся измерением лишь несколь­ ких аминокислот пептидных или белковых гидролизатов, были выполнены уже давно [25, 69, 88, 147]. Наиболее полными яв­ ляются данные Герке; проведенное им газохроматографическое определение аминокислот в гидролизатах бычьего сывороточ­ ного альбумина, каппа казеина, белка бобов [41] и рибонуклеазы [43] прекрасно согласуется с результатами, полученными на ионообменниках. В табл. 5, 6 и 7 приведены некоторые экс­ периментальные данные, полученные ГХ м-пропйловых эфиров ацетиламинокнслот из нескольких пептидных гидролизатов. Для гидролизатов фибринопептидов те же молярные соотно­ шения (табл. 6) найдены на ионообменниках [62]. С помощью ГХ контролировался синтез браднкинина (табл. 7).

Таблица 5.

ДАННЫЕ ГАЗОХРОМАТОГРАФ11ЧЕСКОГО АНАЛИЗА

ОКОЛИЧЕСТВЕ (МОЛЬ Ю- 9 ) АМИНОКИСЛОТ

ВГИДРОЛИЗАТАХ ТРЕХ ДИПЕПТИДОВ

Авторы этой главы определили содержание свободных ами­ нокислот в сыворотке после депротеинизации и очистки на смоле дауэкс-50 — эта процедура, вероятно, необходима в слу­ чае всех образцов биологического происхождения, для которых существует вероятность загрязнения большим избытком белка. Элюированные с бумаги пептиды можно сконцентрировать перед гидролизом адсорбцией на маленьких колонках с дауэк- сом-50 (в Н+-форме) с последующим количественным вымыва­ нием смесью триэтиламина, воды и ацетона (24 : 24 : 7). В опы­ тах с добавлением аминокислот к исчерпывающе диализован-