книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

Таблица 3

соединения намного более устойчивы [78]. Аналогичные разли­ чия в устойчивости наблюдаются в присутствии полярных жид­ ких фаз (см. разд. 2.4.7).

2.4.6.Выбор эфиров ациламинокислот для ГХ*

Выбор определенного производного для газохроматографи­ ческого анализа диктуется рядом взаимозависимых требований: простотой приготовления, высоким выходом, устойчивостью и летучестью производных, а также наличием колонок и хрома­ тографических условий, пригодных для их разделения.

Несколькими группами авторов проведено сравнение лету­ честей различных ациламинокислот и их эфиров. Были изме­ рены температуры плавления [142] и, что более существенно, температуры возгонки [138] и давления паров [140] ряда N-ТФА-аминокислот; в вакууме (0,02—0,06 мм ртутного столба) некоторые ТФА-аминокислоты сублимировались при темпера­ туре от 70 до 80 °С (тирозин, триптофан и лизин составляли исключение), тогда как соответствующие метиловые эфиры воз­ гонялись приблизительно на 40 °С ниже. В газохроматографи­ ческом исследовании наиболее значительной является сравни­ тельная оценка времен удерживания или температур для раз­ личных производных, хроматографированных в одинаковых условиях. При увеличении длины цепи этерифицирующего спирта возрастает время удерживания [83]; с другой стороны, метиловый и н-бутиловый эфиры N-ТФА-аминокислот более летучи, чем соответствующие N-ацетильные производные [78, 83]. (Выбранное производное должно обладать достаточной-

* С м , р а з д . 2 .7 .2 и 2.7,5 .

116 ГЛАВА 2

летучестью, чтобы элюироваться в рамках программы времени и температуры, определяемой жидкой фазой; слишком высокая летучесть может привести к скоплению пиков в начальной ча­ сти хроматограммы, а также к несомненным механическим по­ терям, если конечной стадией получения производного является упаривание.)

Хотя Герке выбрал н-бутиловые эфиры [78], на основании количественного измерения потерь при упаривании эфиров N-ТФД-аланина было сделано заключение, что достоверные результаты можно получить только с «-амиловыми производ­ ными [27]. Потерь метиловых эфиров N-ТФА-аминокислот уда­ валось избежать только при упаривании избытка реагентов при низкой температуре [30]. По предварительным данным, по­ лученным в лаборатории авторов, метиловые, этиловые и н-пропиловые эфиры ацетилированных аминокислот пригодны для газохроматографического разделения в интервале темпе­ ратур 100—240 °С. Этерификация проходит быстро, и при про­ стой двухстадийной методике получения ацетил-н-пропиловых эфиров [23] нет потерь, связанных с упариванием (табл. 4). По этим причинам, а также из-за легкости разделения на покры­ тых карбоваксом хромосорбах G или W (высококачественные), мы остановили свой выбор на ацетил-н-пропиловых эфирах

(см. разд. 2.4.7).

Ацетилированные О- и S-группы сравнительно устойчивы. Для ацетилирования дихлоргидрата эфира аргинина ацилирующей способности уксусного ангидрида недостаточно. Необхо­

Из-за высокой летучести, связанной с ТФА-группой, во избе­

После обработки в каждую пробирку добавляли внутренний стандарт норлейцин. Испаряющий газ: сухой азот, пропускаемый со скоростью 1200 мл/мин через прибор, используемый обычно для получения производных (рис. 8, разд. 2. 4. 8).

высших спиртов. Для этерификации бутанолом или «-амило­ вым спиртом требуется продолжительное время, что же ка­ сается надежности, то полное трифторацетилирование может быть достигнуто с трифторуксусным ангидридом при 150 °С. ТФА-производные менее устойчивы, чем ацетильные, и в раз­ деле 2.4.7 обсуждаются проблемы, возникающие в результате колоночной деструкции О- и S-ТФА-производных.

2.4.7.Носители, жидкие фазы и способы разделения эфиров ациламинокислот методом ГХ*

2.4.7.1.Носители

Наиболее широко используемыми носителями для насадоч­ ных колонок были специально приготовленные и сортированные диатомитовые земли. Поверхность этих материалов модифициро­ вали различными способами, но, по общему мнению, два вида обработок особенно улучшали ее свойства: промывка сильными минеральными кислотами для удаления ионов металлов и «дез­ активирование» поверхности силанизирующими реагентами. На поверхности кремнийсодержащих материалов имеются ак­ тивные центры двух типов: (а) протонодонорная силанольная (—Si—ОН) группа и (б) протоноакцепторная силоксановая (—Si—О—Si—) группа. Активность первой можно блокиро­ вать реакцией с ГМДС или ДМХС.

I

снг

* С м . т а к ж е р а зд . 2 .7.1.

118 ГЛАВА 2

Поверхности носителей, подвергшихся такой обработке, хими­ чески менее активны, чем у необработанных носителей.

По способности к разделению м-пропиловых эфиров ацетиламинокислот без образования хвостов различные носители можно расположить в ряд, который приблизительно соответ­ ствует степени дезактивирования поверхности. С 0,5—1% карбовакса 6М мы получили следующий ряд в порядке воз­

н-бутиловых эфиров ТФА-аминокислот. Без такой обработки пик тирозина отсутствовал, а пик серина имел значительно меньшую интенсивность. Улучшение разделения было припи­ сано удалению следов воды, однако могло иметь значение и некоторое изменение поверхностной активности [43]. Причину невоспроизводимого элюирования производных (главным об­ разом основных аминокислот) часто относят за счет жидкой фазы [40], но в общем случае следует учитывать и роль носи­ теля [93]. Авторам статьи, например, при температуре до 300 °С

ляется носитель. Мы считаем, что взаимодействие между жид­ кой фазой, носителем и разделяемыми веществами часто играет важную роль в разделении. Эти вопросы будут обсуждаться после рассмотрения жидких фаз.

2.4.7.2. Неподвижные фазы

Разнообразие имеющихся в настоящее время жидких фаз ГХ, многие из которых применялись для разделения производ­ ных аминокислот, ставит исследователя в затруднительное по­ ложение. В ряде работ [13, 14, 27, 29, 40] проведена оценка приблизительно 100 неподвижных фаз, включая силиконы, по­ верхностно-активные соединения, полиэфиры, полигликоли, ме­ таллоорганические соединения и многие другие. Стараясь выде­ лить наиболее характерные особенности, мы опустим подробно­ сти, касающиеся размеров колонок, температурных режимов, потоков газов-носителей и условий нанесения жидких фаз.

2.4.7.3. Силиконы

В общем случае с ростом полярности жидкой фазы разде­ ление улучшается. Как класс, силиконы являются наименее

Каталитическое отщепление лабильных групп (в особенно­ сти О-ТФА-серина, тирозина и оксипролина) не является проб­ лемой при работе на силиконах [13, 14, 27, 29]. Силиконовые фазы, по-видимому, обязательны для количественной ГХ арги­ нина, гистидина и цистина; это относится как к ацетильным, так и ТФА- и ТМС-производным.

2.4.7.4. Полиэфиры

Эти жидкие фазы по своей полярности располагаются между силиконами и полигликолями; они получили значитель­ ное распространение, однако приводят к посредственным ре­ зультатам. Обычно используются покрытия в интервале от 0,75 до 2% по весу, но иногда и больше. Из девяти исследовав­ шихся полиэфиров [27] наиболее полярным оказался БДС, а наименее полярным — НПГГ *. Выбор полиэфир^ диктуется не только разрешающей способностью, но и легкостью, с ко­ торой эти фазы каталитически разрушают дополнительно ацилированные аминокислоты. Чувствительность последних к де­ струкции на колонке приблизительно соответствует их устойчи­ вости к воде или метанолу, при этом наиболее чувствительны серин, цистеин и гистидин, а наибольшую устойчивость имеет треонин. Амиловый эфир N, О-ди-ТФА-серина не элюируется с БДС, НПГСб, НПГГ, ППСб и Hi-Eff-8B, а соответствующее производное треонина не удалось элюировать с последних двух фаз [27]. ТФА-цистеин и оксипролин разрушались на ряде полиэфиров (Hi-Eff-8B, ДЭГА, ДЭГС, ПЭГС, НПГГ и ППСб) [13]. Во всех вышеупомянутых работах использовался носитель силоцель С-22 с 5% жидкой фазы. От этих данных отличаются результаты Герке, получившего хроматографические пики н-бу­ тиловых эфиров ди-ТФА-серина, треонина, цистеина и оксипро­ лина на НПГСб и ДЭГС [41]. Маловероятно, чтобы расхожде­ ния были связаны с различием эфирных групп, поэтому для лучшей согласованности данных следует учесть различие в но­ сителях (хромосорб G или W), а также меньшее содержание жидкой фазы (0,5% НПГСб; 0,75% ДЭГС — 0,25% ЭГСС-Х).

При разделении 17 аминокислот .на НПГ-полиэфирах наи­ большая эффективность колонки наблюдалась в случае дикарбоновой кислоты с 10 углеродными атомами, т. е. с НПГСб [43]. Тем не менее самым ценным полиэфиром для разделения н-бутиловых эфиров ТФА-аминокислот является, вероятно, ЭГА, обладающий повышенной термической устойчивостью [43, 118]. Для этих производных наблюдались сдвиги пиков при увеличении содержания ЭГА на хромосорбе W от 0,5 до 2%

* С ок р ащ ен и я см . в р а зд . 2.6.