книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

термоионный детектор обладает тем преимуществом, что он на­ много более специфичен для фосфорсодержащих аминокислот. До настоящего времени получены аминокислоты, фосфорилированные только по а-аминогруппе [35].

2.2.8.Эфиры алкилиден- и алкиламинокислот

Хлоргидраты метиловых эфиров аминокислот реагировали с изомасляным альдегидом и сульфитом натрия в растворе кар­ боната натрия согласно следующему уравнению [31]:

Образующиеся эфиры алкилиденаминокислот хроматографиро­ вали как таковые или же восстанавливали цинковой пылью в метанольном НС1 до алкиловых эфиров

RCHCOOCH3

I

HNCH2R'

Эти производные разделяли на капиллярных колонках с карбоваксом 1540. Этот метод имеет, по-видимому, ограниченное применение, так как получены выходы лишь 50—70%, а произ­ водные аргинина и гистидина подвергались разложению.

2.2.9.Иодсодержащие аминокислоты *

Для иодсодержащих аминокислот, важных для медицинских целей, характерен низкий уровень их нормального содержания в крови, поэтому для их разделения решено было использовать присущую ГХ чувствительность. Клинический интерес представ­ ляют шесть аминокислот: моноиодтирозин, дииодтирозин, дииодтиронин, 3,3',5'- и 3,5,3'-трииодтиронин, а также 3,5,3',5'-тетра- иодтиронин. Для этих соединений приняты сокращения МИТ, ДИТ, Тг, Тз, «обратный» Тз и Т4. Аминокислота Т4— это тироидный гормон тироксин, тогда как Тз обладает аналогичной, но еще большей физиологической активностью, а обратный Т3 дей­ ствует как антагонист Т3 и Т4. Относительно концентраций этих веществ у больных и у здоровых людей имелись различные мнения [97, 133, 134], что стимулировало поиск новых методов анализа. Присутствие иода в аминокислотах позволяет приме­

* С м . т а к ж е р а зд . 2.7.7.

нять чувствительный электронозахватный детектор, но трудность состоит в том, чтобы придать летучесть таким большим поляр­ ным молекулам (молекулярный вес тироксина 777) и разделить их на колонках при умеренных температурах. Большая часть работ выполнена на искусственных смесях иодсодержащих ами­

нокислот.

Силильные производные приготовлены реакцией соответ­ ствующих аминокислот с БСА * [1, 3, 112]. Использовали и другие силилирующие реагенты, ТМХС и ГМДС [112], которые, как оказалось, не приводят к 100%-ному превращению в ТМСпроизводное. Во всех работах получено удовлетворительное раз­ деление на колонках с силиконовыми фазами, однако сведения об анализах природных смесей отсутствуют. Только в одной ра­ боте [3] упоминается о трудностях при экстракции природных смесей из крови. В той же работе [3] продемонстрировано опре­ деление МИТ в количестве до 6 *10-12 моля с помощью электро­ нозахватного детектора, а в работе [112] сообщается об опреде­ лении до 6 • 1011 моля МИТ с использованием пламенно-иони­ зационного детектора. Указанные чувствительности как раз имеют порядок величин, позволяющий анализировать один или несколько миллилитров цельной крови. Недостатком триметилсилилирования является его заметная неспецифичность, поэтому многие из сопутствующих соединений образуют производные, появляющиеся на хроматограммах при использовании пламенно­ ионизационного детектирования. Электронозахватный детектор должен устранить этот недостаток. Иодированную контрастную среду, которая может мешать количественному анализу иодиро­ ванных аминокислот, предварительно отделяют от их ТМС-про-

кзводных при использовании ГХ.

Метиловые эфиры иодированных аминокислот синтезировали при использовании НС1 в метаноле [70, 102] или тионилхлорида в метаноле [70, 122], а полученные эфиры ацилировали затем трифторуксусным [102] или пивалиновым ангидридом [70, 122]. Метиловые эфиры трифторацетильных производных хорошо разделялись на жидкой фазе SE-30 с пламенно-ионизационным

Для анализа крови использовались лишь Ы,0-дипивалоилмети- ловые эфиры; удовлетворительные результаты Получены с 5 мл сыворотки, жидкой фазой OV-17 и электронозахватным детек­ тором. Тз хроматографировали в количестве 10-12 моля — теоре­ тически такое малое количество можно получить приблизительно из 0,02 мл цельной крови. Ацетильная группа для ацилирования не применялась, однако нет видимых причин, по которым

С ок р ащ ен ия см . в р а зд . 2.6.

1М,0-ацетилметиловые эфиры должны труднее получаться ими, быть менее устойчивыми, они должны также легче подвергаться хроматографическому разделению. Уксусная кислота более ле­ туча, чем пивалиновая, поэтому можно ожидать, что ацетиль­ ные производные окажутся более летучими, чем пивалильные.

СНз

N, О-дипивалоилметиловый эфир Т4

Известно, что ДИТ встречается в некоторых кораллах, где ему иногда сопутствует дибромтирозин. С помощью ГХ эти сое­ динения можно легко идентифицировать и анализировать.

2.2.10.Сульфо- и селеноаминокислоты

2.2.10.1.Серусодержащие аминокислоты

Метионин и цистеин, а также некоторые продукты распада метионина хроматографировали рядом методов, однако воз­ никли сомнения относительно того, какие же продукты распада были подвергнуты хроматографическому анализу. Цистин и цистеиновая кислота, по-видимому, представляли трудности для большинства исследователей, в особенности это касается их N-ацилэфиров. Цистеиновая кислота, вероятно, слишком полярна вследствие наличия — SO3H группы, тогда как молекула цистеина очень большая (М 240) и с трудом этерифицируется [41]. Исследовали ТМС-производные цистеина, цистина, цистеиновой кислоты, ряда небелковых серусодержащих амино­ кислот и продуктов распада (S-метилцистеин, таурин, гомоцис­ тин, дьенколевая кислота и этионин [111], а также цистеинсульфиновая кислота [18]). С использованием БСА [118, 111] и БСТФА [111]* достигались различные степени превращения. БСТФА [111] наиболее пригоден для всех перечисленных выше аминокислот, за исключением S-метилцистеина, более высокую степень превращения которого обеспечивает БСА.

С ок р ащ ен и я см , в р а зд . 2.6.

2.2.11.Разделение стереоизомеров*

Удельное вращение плоскости поляризации света энантиоме­ рами многих биологически активных молекул часто мало; поля­ риметрические методы не всегда достаточно чувствительны, чтобы обнаружить следы изомера, сопутствующего большому избытку антипода. Такой анализ может иметь важное значение по нескольким причинам. При получении биологически актив­ ных пептидов влияние изомерных примесей кумулятивно: при­ сутствие 1% D-аминокислоты в каждой из аминокислот, вошед­ шей в 10-членный пептид, приведет к неактивному на 10% сое­ динению. Другая область, представляющая значительный инте­ рес, относится к обнаружению внеземной жизни. Уникальной особенностью макромолекул биологического происхождения яв­ ляется их способность различать и избирательно включать опре­ деленные оптические изомеры. Обнаружение преобладания одного оптического изомера на отдаленной' планете может рас­ сматриваться как указание на существование жизни [59]. Неуди­ вительно, что, несмотря на трудность разделения оптических изомеров на обычных жидких фазах, ГХ уделялось значительное внимание как быстрому способу их разделения и идентифика­ ции. Особенно успешными оказались два следующих подхода: (а) применение оптически активных жидких фаз и (б) введение в разделяемые соединения второго асимметрического центра.

2.2.11.1.Применение оптически активных жидких фаз

Первоначально этот метод был безуспешно применен к не­ скольким рацемическим смесям, не являющимися смесями ами­ нокислот [51, 73, 74], хотя в некоторых случаях достигалось очень слабое разрешение. На капиллярных колонках с лауриловым эфиром N-ТФА-изолейцина в качестве жидкой фазы [48] иссле­ дованы и частично разделены производные N-ТФА-аланина, этерифицированные четырьмя спиртами. Авторы этой работы опи­ сали почти полное разделение грег-бутилового эфира ТФА-ала- нина с циклогексиловым эфиром Ы-ТФА-ь-валил-ь-валина в качестве жидкой фазы на набивной колонке длиной, всего 2 м' [46]. Авторы полагают, что N-ТФА-грег-бутиловые эфиры других аминокислот должны разделяться на той же колонке. На капил­ лярных колонках с использованием лаурилового эфира N-ТФА-

В условиях хроматографирования не происходит рацемизации эфиров N-ТФА-аминокислот [101], поэтому указанным методом можно точно определить долю каждого изомера в смеси. Воз-

* См . т а к ж е р а зд . 3 .6 этой книги.

можные механизмы разделения рассматриваются в работах [37, 48, 120 и 135], при этом с разделением стереоизомеров связаны главным образом две последние статьи. Между разделяемыми изомерами и жидкой фазой, как полагают, существуют водород­ ные связи и, вероятно, электронные взаимодействия. В присут­ ствии оптически активной жидкой фазы из одного энантиомера непрочные диастереомеры будут образовываться несколько легче, чем из другого, и, следовательно, они будут удерживаться на колонке несколько дольше. Применение лаурилового эфира ь-изолейцина в качестве жидкой фазы показало, что изопропи­ ловые эфиры N-ТФА-ь-аминокислот удерживаются дольше со­ ответствующих D-эфиров, тогда как с лауриловым эфиром D-изолейцина наблюдается обратный порядок элюирования [48]. Функциональные группы, находящиеся в непосредственной бли­ зости от асимметрического центра, придают большие различия во временах удерживания, чем удаленные группы. Оптическую чистоту определяли также методом ЯМР в оптически активных растворителях [17, 95]. Метод ЯМР, а также метод ГХ на опти­ чески активных неподвижных фазах обладают тем преимуще­ ством, что позволяют точно определять концентрацию энантио­ меров в рацемической смеси. В любом из методов присутствие в оптически активном растворителе другого энантиомера отра­ зится на разделении, но не на определении абсолютных коли­ честв в рацемических смесях.

Если для гомологического ряда нанести логарифмы удержи­ ваемых объемов в зависимости от числа углеродных атомов, то для каждой конфигурации получится своя прямая линия [19, 37, 45, 49]. ГХ может найти применение как способ быстрого уста­ новления абсолютной конфигурации неизвестного соединения.

2.2.11.2.Диастереомеры

Более детально разработан метод введения второго асиммет­ рического центра в соединения рацемических смесей. В ряде систем наблюдалось, что при разделении l l , l d , d l и d d диастереомеров на оптически неактивных неподвижных фазах l l - и d d - соединения элюируются вместе перед l d - и DL-изомерами, кото­ рые также выходят вместе [45, 100, 127]. Это означает, что для

однозначного разделения рацемической смеси при введении вто­ рого асимметрического центра следует применять чистые энан­ тиомеры. В связи с разделением диастереомерных дипептидов на сефадексе [146] было высказано предположение о том, что в d l

соединениях предпочтительно образование циклических струк­ тур, тогда как в l l - и DD-формах существует тенденция к сохра­

нению вытянутых цепей. Диастереомеры использовались для разделения оптических изомеров путем кристаллизации еще со

4 Зак , 26

98 ГЛАВА 2

времен Пастера. С помощью этого метода недавно были полу­ чены оптически чистые спирты для этерификации аминокислот [62]. Близость двух асимметрических центров и функциональных групп способствует разделению ГХ, и вполне вероятно, что, как и для упоминавшихся выше оптически активных фаз, разделе­ ние определяется электронными эффектами и водородным свя­ зыванием между диастереомером и неактивной жидкой фазой [120, 135]. На таких полярных фазах, как карбовакс, достигается лучшее разделение, чем на неполярных [101, 135].

Ы-ТФА-о-2-бутнловые эфиры разделяли на капиллярной ко­ лонке с карбоваксом 1540 или юконом LB 550 [100]. DD-эфиры элюировались раньше LD-соединений, и этим тестом определяли рацемизацию 11 аминокислот в ходе кислотного гидролиза бычьего сывороточного альбумина. Использовавшийся для по­ лучения эфиров бутаиол-2 содержал, к сожалению, только 90% D-изомера, тем не менее эта работа намечает путь развития точ­ ного анализа рацемических смесей. Для исследования рацеми­ зации, протекающей в ходе различных методов пептидного син­ теза, применяли также метиловые эфиры N-ТФА-валилвалина [143]. Эфиры N-ТФА-аминокислот со вторичными спиртами ис­ пользовали в исследовании ряда стереоизомеров: валин и ала­ нин [19], конфигурация аминокислот в антибиотике дорицин [20]; аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, глутаминовая кислота [44]; треонин, серин, оксипролин, цистеин, аспарагиновая кислота, тирозин и триптофан (О-ацетил, где это необходимо) [99]; аланин, валин, лейцин, изолейцин, алло- изолейцин (в этой работе для метионина, оксипролина, лизина, аспарагиновой и глутаминовой кислот — соединений с дополни­ тельными функциональными центрами — были получены плохо воспроизводимые результаты) [45]; и для исследования рацеми­ зации на колонках [101]. В нескольких работах второй асиммет­ рический центр вводили с помощью дипептидов: метиловый эфир L-сс-хлоризовалериламинокислоты [58]; метиловый эфир N-ТФА-ь-пролиламинокислоты [59, 60] (получение диастереомеров) [139]; N-ТФА-валилвалин (рацемизация в ходе пептидного синтеза) [143]; все комбинации аланина, глицина, валина, лей­ цина, изолейцина, метионина и фенилаланина в виде метило­ вых эфиров N-ТФА-дипептидов [141]; Ы-ТФА-S *-пролиламиды асимметрических аминов и эфиры аминокислот [135]. Исследо­ вались также ь-ментил-И-ТФА-аминокислоты [127].

Перевод в дипептиды для введения второго асимметриче­ ского центра приводит к потере летучести, поэтому маловеро­ ятно, чтобы таким образом. можно было анализировать мало

* Относится к S — /^-номенклатуре для обозначения оптически активных соединений.

летучие аминокислоты. По этой причине, а также из-за того, что для точного определения состава рацемических смесей расщеп­ лением их на диастереомеры необходима оптическая чистота одного изомера, создается впечатление, что большее значение вскоре приобретет анализ рацемата непосредственно на оптиче­ ски активных неподвижных фазах.

2.2.12.Методы единичного, ограниченного или недавно предложенного применения

В этом разделе будут перечислены методы, не попавшие в другие разделы, потому что возможность их общего применения пока еще не доказана или не может быть доказана вообще.

Были приготовлены N-пентафторпропионил- и N-гептафтор- бутирилпроизводные для сравнения их с более привычными трифторацетильными производными. Эти производные для 14 аминокислот имели меньшие времена удерживания, чем со­ ответствующие ТФА-производные [98]. Автор рассматривает в качестве возможного преимущества для ГХ их большую лету­ честь и чувствительность к детектированию по электронному за­ хвату, хотя никаких количественных исследований он не про­ водил.

Для выяснения вопроса о присутствии цис-транс-З-окся-L- пролина в теломицине [68] М-карбобензокси-гранс-З-окси-оь- пролин был подвергнут хроматографическому анализу. Не­ сколько других изомерных производных пролина разделили в виде N-ацетил-н-бутиловых эфиров после удаления а-амино- групп остальных аминокислот в результате обработки азоти­ стой кислотой, оставляющей интактными иминогруппы изомеров пролина [92].

Реакция конденсации аминокислот с гександионом-2,5 [131] недавно предложена для использования в ГХ:

СН3

I

С

+ h 2n - r

Н2С \ с

I

СНз

Продукт конденсации этерифицируют затем раствором НС1 в метаноле. Эта реакция описана только для нескольких амино­ кислот, причем количественные данные не приводятся.

4 *

2.3.ТРИМЕТИЛСИЛИЛАМИНОКИСЛОТЫ

Замещение протона на триметилсилильную (ТМС)-группу (термин силилирование обычно используется именно в этом контексте) успешно применялось для приготовления летучих производных таких биологически важных соединений, как са­ хара [124], пуриновые и пиримидиновые основания,' нуклеозиды и нуклеотиды [42], стероиды [126], амины [63] и аминокислоты. В настоящее время имеется целый ряд реагентов и огромное число методов силилирования, причем выбор конкретных усло­ вий определяется исследуемым соединением и масштабами про­ водимой реакции. Соответствующие методы рассматриваются в появившемся недавно обзоре [94].

2.3.1.Силилирование с помощью ТМХС, ГМДС и ТМС — ДЭА *

Значительная часть работы была выполнена в основопола­ гающих исследованиях Рюльмана, изучавшего реакции транс- силилирования ТМС-аминокислот и аминов [104] и обнаружив­ шего неустойчивость ТМС-производных в водных, спиртовых и эфирных растворах. Отдельные силилированные группы в пол­ ностью силилированной аминокислоте значительно различаются по лабильности. На аминокислотах и модельных соединениях — гексановая кислота (СООН), октанол-1 (ОН) и н-октиламин (NH2) — было показано, что Si—N-связь более лабильна, чем Si—О-связь гидроксильной группы, которая, в свою очередь, ла­ бильнее связи Si—О карбоксильной группы [87]. Эти группы располагаются в обратном порядке по легкости введения ТМСгруппировок: карбоксильная группа легче всех силилируется и соответствующее производное наиболее устойчиво. При действии N-TMC-имидазола будет протекать силилирование ОН-групп, но не основных ЫНг-групп [63]. В какой степени возможно силили­ рование гуанидина, остается неизвестным, но можно думать, что эта группировка с наибольшей трудностью будет подвергаться превращению и окажется наиболее лабильной.

Можно полагать, что силилирование аминокислоты протекает в две стадии:

Этерификация карбоксильной группы происходит легче и мо­ жет осуществляться в мягких условиях с применением ГМДС

* С м . сок р ащ ен и я в р а зд . 2.6.

[9, 10], но для основной аминогруппы и таких группировок, как

—ОН и —SH, требуются более жесткие условия. ГМДС, один или вместе с ТМХС, не дает удовлетворительных выходов [114]. Более эффективной оказалась реакция натриевых солей ами­ нокислот с ТМХС [103] или ТМС — ДЭА [87, 105, 114].

Так силилировались ОН- и SH-группы, а также имидазольная группа гистидина [105]. Лучшие выходы для нескольких ТМСаминокислот составляли 75% [114]. С помощью ГХ с примене­ нием силиконового масла в качестве жидкой фазы [106] были разделены производные аланина, валина, лейцина, глутамино­ вой кислоты и фенилаланина. Хроматографированию подверга­ лись также этиловые эфиры N-TMC-аминокислот наряду со свободными основаниями ТМС-эфиров, приготовленными ре­ акцией аминокислот с ГМДС или же удалением лабильной N-TMC-группы аммиаком [107]. Авторы утверждают, что полу­ чены пики аргинина, гистидина и лизина, но не приводят для них времен удерживания.

2.3.2.Силилирование силиламидами

Введение в практику БСА, который, как уже упоминалось, в качестве силильного донора в 50 раз активнее любого монозамещенного амида, позволило осуществить быстрое и ко­ личественное силилирование амидов, мочевин, аминокислот, про­ странственно затрудненных фенолов, карбоновых кислот и енолов [77]. Данные ЯМР и ИК свидетельствуют о предпочтитель­ ности изомера I, для которого характерен быстрый внутримоле­

Реакционную способность можно объяснить конкурированием одной ТМС-группы за О- или N-положение, ослабляющим