книги из ГПНТБ / Дашевский, В. Г. Конформации органических молекул

предпочтительны гош-конформации с углами вращения ср, ф, рав­ ными соответственно 60°, 60° или 300°, 300°, менее выгодны дру­ гие комбинации гош-конформаций. Такого типа конформации наб­ людались в экспериментальных исследованиях подобных моле­ кул.

Итак, в отличие от пептидных производных, двумерные конформационные карты которых позволяют найти положение и фор­ му минимумов мономерной единицы, при решении подобных задач для производных нуклеотидов мы сразу же сталкиваемся с проб­ лемой многих минимумов, и решение ее, вероятно, будет не про­ сто.

2. КОНФОРМАЦИИ ОДНОТЯЖЕВЫХ ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ

Рассматривая мономерные единицы или нуклеотидные фрагмен­ ты, содержащие не более одного основания, мы могли ограничить­ ся учетом только атом-атом потенциалов. При переходе к олиго­ мерам и полимерам важно принять во внимание большую роль гидрофобных, точнее, сольватофобных взаимодействий. Действи­ тельно, нативные нуклеиновые кислоты, в которых основания рас­ положены стопкообразно, существуют только в водных растворах в определенном интервале температур; в органических раствори­ телях или при повышении температуры они денатурируют.

Важную роль гидрофобных взаимодействий в формировании пространственной структуры олиго- и полинуклеотидов впервые подчеркнули и попытались теоретически объяснить Синаноглу и Абдульнур [29]. Эта роль сводится к тому, что в системе поли­ нуклеотид — растворитель возникают силы, препятствующие кон­ тактам неполярных оснований с полярной жидкостью (водой), и они способствуют сближению оснований и возникновению стопко­ образной конформации (подобным же образом стремятся прийти в соприкосновение друг с другом неполярные группы R в белках).

Следует еще сказать, что если мы хотим оценить свободную энергию полинуклеотида, то непременно должна быть учтена кон­ фигурационная энтропия. В принципе ее можно рассчитать, ис­ пользуя потенциальные функции, как это делал Флори для поли­ пептидов, с той лишь разницей, что интегрирование придется ве­ сти не в двумерном, а в шестимерном пространстве. Большая роль конфигурационной энтропии следует из того, что при создании жесткой столкообразной конформации вращение вокруг одинар­ ных связей резко ограничивается. Во всяком случае именно кон­ фигурационная энтропия несет основную ответственность за раз­ ность свободных энергий двухтяжевых полинуклеотидов (в кото­ рых внутреннее вращение вокруг 10 связей практически полно­ стью заторможено) и однотяжевых полинуклеотидов, образующих­ ся в результате денатурации.

411

Изменение свободной энергии полинуклеотида при любой конформационной перестройке (в частности, при переходе от упорядо­ ченной стопкообразной конформации к неупорядоченной) может быть записано в виде

где A/Vb — изменение энергии невалентных взаимодействий, вы­ ражаемой с помощью атом-атом потенциалов; AF3„ — изменение электростатической энергии и AS — изменение энтропии, вклю­ чающее энтропию растворения (т. е. гидрофобные взаимодействия) и конфигурационную энтропию.

Впервые вопрос о количественном вкладе различных сил, опре­ деляющих конформацию, в полную энергию полинуклеотида был поставлен в работе Де Во и Тиноко |30]. Невалентные взаимодей­ ствия оценивались весьма сложным и спорным образом, но полу­ ченные значения по порядку величины сопоставимы с результа­ тами более поздних работ. Вычисление электростатической энер­ гии проводилось в диполь-днпольном приближении, причем то­ чечными диполями служили целые осногаиия. Величина измене­ ния энтропии растворения (AS = +28 з. е. на моль) была взята авторами из работы Козмана 131 i, изучавшего растворение бензо­ ла в воде. Изменение конфигурационной энтропии рассчитыва­ лось по формуле AS = Д’ InZ, где Z — статистическая сумма, и составляет по разным подсчетам —4,6 или —13,1 э. е., в зависимо­ сти от числа устойчивых конформационных состояний при вра­ щении Еокруг одинарных связей в полинуклеотиде.

В последующих многочисленных работах 132—351 количествен­ ные оценки, сделанные Де Во и Тиноко, неоднократно критико­ вались, в частности все авторы указывали на недопустимость при­ ближения точечных диполей и проводили учет кулоновских взаи­ модействий, центрируя заряды на атомах оснований. Коррект­ ность той или иной параметризации для различных составляю­ щих свободной энергии полинуклеотида и в настоящее время не может быть доказана с определенностью. Между тем основные идеи были высказаны именно Де Во и Тиноко и ими же теорети­ чески было установлено наличие сильных стэкинг-взаимодей- ствии, стабилизирующих структуру однотяжевых п двухтяжевых полинуклеотидов, в то время как водородные связи, на которых основывалась модель Уотсона и Крика, играют второстепенную роль. Анализируя результаты расчетов различных авторов, мож­ но отметить, что хотя между ними нет количественного согласия, качественный вывод Де Во и Тиноко о доминирующей роли стэ- кинг-взакмодействий в стабилизации конформаций дикулеозкдфосфатов, олигомеров, а также однотяжевых и двухтяжевых по­ линуклеотидов разделяется всеми авторами.

Приведем несколько цифр, характеризующих взаимодействия оснований, уложенных в стопку 1351. Для двух молекул аденина, расположенных одна под другой, энергия электростатических вза­

412

имодействий составляет 0,98 ккал/моль, энергия притяжения не­ связанных атомов 10,96 ккал/моль и энергия отталкивания 2,47 ккал/моль; для молекул тимина соответствующие значения равны 0,62; 7,00 и 2,34 ккал/моль и т. д. Таким образом, наиболь­ ший вклад принадлежит дисперсионным взаимодействиям, отно­ сительно слабо зависящим от последовательности оснований и быстро убывающим с расстоянием (для оснований, отделенных одно от другого всего лишь одним нуклеотидным звеном, дисперсион­ ная энергия уменьшается в 30—40 раз по сравнению с энергией взаимодействия соседних оснований). Электростатическая энер­ гия почти во всех вариантах имеет знак - f, т. е. противодействует укладке оснований в стопку.

Конечно, ценность такого рода оценок снижается вследствие того, что влияние растворителя в них никак не учитывается, и по­ лученные цифры справедливы для вакуума. В водных растворах, полинуклеотидов гидрофобные взаимодействия должны дополни­ тельно стабилизировать укладку оснований в стопку. Действи­ тельно, стабилизации невалентнымп взаимодействиями (5— 8 ккал/моль-основание) еще недостаточно, чтобы сделать энергию системы полинуклеотид — растворитель минимальной для этой конформации: в органических растворителях (например, поли-С в этиленгликоле [36]), которые, как известно, являются эффектив­ ными денатурантами, минимум свободной энергии соответствует беспорядочной конформации полинуклеотида. За возникновение беспорядочной конформации ответственна при этом конфигура­ ционная энтропия, которая резко повышается при «разморажива­ нии» вращений вокруг одинарных связей рибозофосфатного ске­ лета.

Имеется немало доказательств того, что пуриновые и пирими­ диновые основания (сами по себе или в составе различных произ­ водных) в водных растворах благодаря сильным стэкинг-взаимо- действиям укладываются в стопку: работы но исследованию спек­ тров ЯМР [37], измерению дисперсии оптического вращения [38], кругового дихроизма [39] и поглощения в ультрафиолетовой обла­ сти [40], измерению осмотического давления [11] и ряд других ра­ бот. Наконец, надо отметить единственные структурные данные для аденилилуридина [42], полученные из анализа рентгено­ грамм. В этой структуре оба основания находятся в анти-кон­ формации, характерной для нуклеозидов, причем основания при­ близительно параллельны (с точностью до 15°) и отстоят одно от другого примерно на 3,4 А.

Не следует, однако, думать, что стэкинг — это непременно пол­ ное наложение плоскостей одного основания на другое. Напро­ тив, в большинстве случаев основания перекрываются лишь час­ тично. Авторы работы [43], проанализировавшие стэкинг в 70 кристаллических структурах нуклеозидов, нуклеотидов и поли­ нуклеотидов, отметили, что, хотя частичное перекрывание осно­ ваний — явление весьма распространенное, нередки случаи стэ-

413

Разумеется, трудно ожидать, что атом-атом потенциалы объяс­ нят все тонкости, связанные с конформацией олиго- и полинуклео­ тидов в растворах; наибольшие затруднения, естественно, воз­ никнут при учете гидрофобных взаимодействий и конфигурацион­ ной энтропии. Поэтому в ряде случаев более грубые модели, в частности комбинаторные, могут иметь больший успех.

Сказанное выше в значительной мере относится к предсказа­ нию вторичной структуры однотяжевых полинуклеотидов в рас­ творах. Еще несколько лет назад, решая вопрос о равновесной конформации однотяжевого полинуклеотида, считали по аналогии с двухтяжевой нативной ДНК, что в этой структуре необходимо комплементарное спаривание оснований между участками той же цепи [46]. При этом образуется так называемая шпилькообразная структура.

Подобные представления легли в основу комбинаторных моде­ лей, предназначенных для предсказания пространственной струк­ туры (или вторичной шпилькообразной структуры) тРНК и иРНКЭти модели основывались на критерии максимального спарива­ ния оснований в шпильках. В частности, В. Г. Туманян [47] раз­ работал общий алгоритм нахождения структуры с максимальным спариванием для любой последовательности оснований в полину­ клеотидах и применил его к расчетам оптимальной структуры аланиновой тРНК (рис. 9.7а).

Однако теперь уже стало ясно, что не водородные связи между основаниями являются определяющими для макроструктуры полинуклеотидов, как считали Уотсон и Крик. Поэтому истинным критерием для нахождения вторичной структуры тРНК и иРНК должна стать максимальная длина регулярного комплементарно­ го участка, в котором основания располагаются стопкообразно (критерий максимального спаривания дает для случайных после­ довательностей весьма дефектные структуры, как это видно, в частности, из рис. 9.7а). Еще лучше, если эти критерии войдут в комбинаторные расчеты с соответствующими весами.

Из-за недостатка места мы не можем сколько-нибудь детально остановиться на интереснейшей проблеме — пространственной структуре тРНКЗаметим лишь, что первичная структура аланиновой тРНК впервые была полностью расшифрована Холли [48]. Им же предложена модель клеверного листа, согласно которой молекула тРНК может быть представлена в виде четырех шпилек (рис. 9.76). К 1970 г. в различных лабораториях мира были рас­ шифрованы нуклеотидные последовательности еще 16 тРНК [49]. Как показал анализ, проведенный, в частности, Левиттом [50], все известные тРНК могут быть представлены в виде клеверных листов с достаточно большим числом спаренных оснований, так что минорные компоненты (псевдоуридин, дигидроуридин и др.) всегда оказываются в петлях, а обычные основания составляют спиральные участки. Разумеется, модель, представленная на рис. 9.76,— еще не пространственная модель; если же в дополне-

415

ние к модели спаривания (вторичной структуре) описать относи­ тельные положения каждой из шпилек, то пространственная струк­ тура тРНК (третичная структура) станет вполне определенной. Согласно современным представлениям, наиболее вероятной иро-

a

Рис. 9.7. Модели вторичной структуры аланиновой тРНК:

а — модель, найденная комбинаторным методом с критерием максимального спарива­ ния; б — «клеверный лист» Холли.

странственной моделью тРНК в растворе считают клеверный лист со шпильками (I) и (III), уходящими за плоскость рисунка, и шпильками (II) и (IV), смотрящими вперед.

3. ДВОЙНЫЕ СПИРАЛИ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ

На протяжении 60-х годов соли щелочных металлов нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов интенсивно исследова­ лись методами рентгеноструктурного анализа кристаллов. Кри­ сталлическая ДНК, в зависимости от влажности, а также содержа­ ния солей щелочных металлов, может иметь три конформации полинуклеотидной цепи. При влажности выше 92%, вне зависимо­ сти от природы противоиона (катиона), ДНК существует в кон-

416

формации В [51]. При 75%--ной относительной влажности натрие­ вая соль ДНК переходит в конформацию А [52], тогда как литиевая соль остается в конформации В даже при относительной влаж­ ности 66%. При 44 % влажности литиевая соль переходит в кон­ формацию С [53]. Природные молекулы, существующие в клетке при высокой относительной влажности, вероятно, имеют конфор­ мацию, близкую к В, хотя в этом случае уже не приходится гово­ рить о строгом дальнем порядке в укладке оснований.

Прежде чем обсуждать сходство н отличие этих кристалли­ ческих модификаций, необходимо условиться об обозначениях, характеризующих конформации двойных спиралей. Как и в слу­ чае кристаллических стереорегулярных полимеров, для кристал­ лов полинуклеотидов можно выделить ось макромолекулы; рент­ генограммы волокна дают сведения о периоде (в данном случае о числе уотсон-криковских пар оснований). Разумеется, этих дан­ ных недостаточно для воспроизведения координат всех атомов — как мы указывали, конформация регулярного полинуклеотида характеризуется шестью независимыми углами вращения.

В структурных работах конформации полинуклеотидов обычно описывают взаимным расположением оснований. Арнотт и;др. [54] предложили характеризовать взаимное расположение оснований пятью параметрами: 04 — углом поворота вокруг оси у' , 02 — углом поворота вокруг оси х ', D — расстоянием начала системы координат со штрихами (х , у , z!) от оси z и двумя пара­ метрами спирали — трансляцией вдоль оси d и углом поворота т вокруг оси спирали (т = 2л/я, где я — число пар оснований в пе­ риоде; d — clti, где с — период идентичности) — см. рис. 9.8.

Рис. 9.8. Параметры, определяющие положение пар оснований в полинуклеотндной цепи.

Система координат на рис. 9.8 выбрана таким образом, что при 0j = 02 = 0 ось х' проходит через атом С4 пиримидина и парал­ лельна прямой, соединяющей атомы углерода гликозидных свя­ зей комплементарной пары. Основания при этом предполагаются плоскими, и для уотсон-криковских пар принимаются средние параметры, которые, по-видимому, практически не должны ме­

няться при переходе от одной конформации макромолекулы к дру­ гой, в частности длина отрезка, соединяющего атомы углерода гликозидных связей комплементарной пары, равна 10,85 А. Ра­ зумеется, в дополнение к указанным параметрам необходимо вве­ сти еще хотя бы один параметр, чтобы полностью определить по­ ложение всех атомов (конечно, мы предполагаем, вслед за Арноттом 154], что связи и валентные углы в полинуклеотиде абсолютно жесткие). Этим одним параметром может быть угол у (или cpCN), или, например, одна из цилиндрических координат атома фосфо­ ра — Арнотт приводит обычно все три координаты.

Форма А ДНК представляет собой двойную спираль с перио­ дом идентичности 28,15 А и 11 уотсон-криковскими парами осно­ ваний в периоде. Согласно проведенному недавно уточнению мо­ лекулярной структуры [54], в основе которого лежало предполо­ жение о неизменности длин связей и валентных углов во всех фор­ мах двойных спиралей ДНК и РНК, форма А имеет следующие параметры 0Ь 02, D d и т: 20°, 8°, 4,75 А, 2,56 А и 32,7°; цилин­ дрические координаты атома фосфора г, 0, zb системе хуг рис. 9.8: 8,84 А, 67,2°, 3,93 А.

Конформация В имеет следующие параметры оснований: —2°, —5°, —63 А, 3,38 А и 36°; координаты атома фосфора: 9,05 А, 94,8°, 2,04 А. Как видим, отличие между конформациями А и В очень велико: если в форме В основания располагаются недалеко от оси двойной спирали и притом почти перпендикулярно этой оси, то в форме А они отстоят от нее на значительном расстоянии

ирасположены наклонно. Кроме того, в конформации В фуранозное кольцо имеет конформацию С2'-эндо, а в форме А — С3'-эндо*.

Форма С ДНК очень близка к форме В. Она характеризуется следующими параметрами оснований: —6°, 5°, —2,13 А, 3,32 А

и38,6°; положение атома фосфора : 9,05 А, 107,5°, 2,95 А; конфор­ мация сахара С„>-Рндо.

Молекулы двухтяжевых РНК имеют несколько кристалличес­ ких модификаций, которые, по-видимому, содержат идентичную

(по геометрии) двойную спираль. Арнотт [541 высказывает мне­ ние, что все исследованные до сих пор РНК имеют 11-кратную спираль (в некоторых исследованиях ранее предполагалась и 10- кратная спираль). Уточненные им геометрические параметры име­ ют следующие значения: 14°, 0°, 4,25 А, 32,7°, 2,73 А; коорди­ наты фосфора: 8,84 А, 68,5°, —3,62 А. Таким образом, молекулы РНК существуют в конформации, очень близкой к форме А ДНК.

* Недавно Арнотт и Хакинс [57] провели еще одно уточнение струк­ туры А и В форм ДНКПри этом выяснилось, что С3>-экзо-конформация углеводного кольца несколько лучше согласуется с наблюдаемым распреде­ лением интенсивности рентгенограмм, чем С2' -эндо-конформация. В связи с этим значения углов внутреннего вращения формы В потребовали неко­ торого пересмотра. Что же касается формы А, то для нее вновь была про­ демонстрирована наибольшая вероятность С3' -эиЗо-конформации сахара.

418

Анализ результатов рентгеноструктурных исследований А и В форм ДНК, а также РНК подтверждает важную роль стзкингвзаимодействий в полинуклеотидах. Перекрывание оснований в форме А ДНК и в РНК больше, чем в форме В ДНК, и, вероятно, по этой причине молекулы ДНК, имеющие в клетке конформацию, близкую к В, менее стабильны, чем молекулы РНК. (первые су­ ществуют в виде двойных спиралей в более узком интервале тем­ ператур).

Интересно поставить вопрос — является ли перекрывание ос­ нований в молекулах ДНК и РНК оптимальным и определяет ли оно геометрию двойных спиралей? Клаври 155], первым детально исследовавший этот вопрос, рассматривал взаимодействия валент­ но не связанных атомов двух уотсон-криковских пар оснований, используя модифицированные потенциалы Китайгородского и учи­ тывая электростатическую энергию в монопольном приближении. При этом взаимное положение оснований описывалось лишь двумя параметрами: d — расстоянием между параллельными парами ос­ нований и т — углом поворота их друг относительно друга. Как показали расчеты, минимум энергии взаимодействия двух распо­ ложенных друг над другом пар оснований соответствует d » 3,4А, однако т ^ 30—40° (угол спирального вращения, характерный для нуклеиновых кислот) не всегда находится в области миниму­ ма.

В работе В. Г. Дашевского и А. Э. Кистера [56, с. 91] потен­ циальная функция взаимодействия оснований минимизировалась по пяти параметрам — 0lf 02, D, d и т. Значения этих пяти пара­ метров в кристаллических полинуклеотидах для большинства пар оснований не соответствуют минимуму энергии. Что же касается координат минимумов, то они в значительной степени определяют­ ся предположениями, сделанными относительно электростатичес­

ниями на геометрию двойной спирали, накладываемыми рибозофосфатным остовом. Впрочем, о роли остова свидетельствует и тот факт, что персистентная длина полинуклеотидов, которая может быть найдена как вторая производная потенциальной энергии по величине, обратной радиусу кривизны (в равновесном положе­ нии), получается заниженной на порядок, если учитывать только взаимодействия оснований. Следовательно, за геометрию и свой­ ства нуклеиновых кислот ответственны не только основания, т. е. не только стэкинг-взаимодействия, но и конформационные воз­ можности рибозофосфатного скелета, и потому для предсказания структуры нуклеиновых кислот имеет смысл искать минимум энергии взаимодействия всех атомов полинуклеотидной цепи по всем важнейшим геометрическим параметрам и в первую оче­ редь по ф, ф, 0, £, (о и х-

Арнотт и Хакинс [17] отметили некоторые важные черты кон­

формации мономерных компонентов и полинуклеотидов, которые могут быть полезны для теоретического конформационного анали­ за. В отличие от элементарных фрагментов полипептидов, конформационные углы мономерных компонентов и нуклеиновых кис­ лот ограничены совсем небольшими интервалами значений. Более того, углы, наблюдающиеся как в мономерных компонентах, так и в полинуклеотидах, почти идентичны.

Для угла вращения ср (см. рис. 9.4) в мономерных компонен­

такой же интервал, £ — 51° ± 4°, характерен идля полинуклеоти­ дов.

Только для угла вращения ш вокруг связи О—С3- (угол со) не имеется соответствия между углами, наблюдающимися в моно­ мерных компонентах и полинуклеотидах: для первых характерен интервал 252° ± 16°, а для вторых — 196° ± 10°. Возможно, что второй ряд значений ие был обнаружен в мономерных компонен­ тах по той причине, что мы располагаем только тремя простран­ ственными структурами нуклеозид-З'-фосфатов.

Наконец, угол вращения х вокруг гликозндной связи (мы уже указывали его связь с tpCN) имеет интервал значений 299° ± 31° для ош-конформации и два интервала для awmw-конформации в мономерных компонентах: 84° ± 7° и 110° ± 10°, причем первый интервал возникает в тех случаях, когда углеводное кольцо нахо­ дится в конформации С3'-эндо и Сз’-экзо, а второй интервал — для конформации С„'-эндо. В полинуклеотидах, для которых характер­ на конформация углеводного кольца С3- -эндо, т. е. в форме А ДНК, в РНК, а также в некоторых синтетических полинуклеотидах угол X ограничен очень узким интервалом значений, 77° ± 3°, в то же время для форм В и С ДНК (конформация сахара С2- -эндо) раз­ брос значений довольно велик: 173° и 139° соответственно.

Конформации углеводного остатка, которые можно характери­ зовать углами o', а", о '" (см. рис. 9.4), имеют интервалы значений этих углов в мономерных компонентах: 204° ± 2°, 37°±4°, 97°±6

420