лы — ван-дер-ваальсовы и электростатические (т. е. невалентные взаимодействия) — проявляются весьма своеобразно: они при водят к сильному «стэкинг»-взаимодействию оснований и опреде ляют пространственную структуру полинуклеотида, состоящего из нескольких и даже двух мономерных единиц. Стэкинг-взаимо- действия способствуют сближению оснований в растворах поли нуклеотидов, так что между основаниями не остается пустот, в которые могли бы проникать молекулы растворителя.
Разумеется, пока мы имеем дело с мононуклеотидами и иуклеозидами, содержащими одно основание, этот эффект не проявляет ся, и их конформации определяются взаимным отталкиванием и притяжением валентно не связанных атомов молекулы. В этом случае влиянием растворителя можно пренебречь.
В чем же отличие полинуклеотидов от обычных полимеров и полипептидов? Прежде всего, гидрофобные силы, которые в по следних начинают проявляться при сравнительно большой длине цепи, когда могут образоваться «внутренние» и «внешние» обла сти, уже в динуклеотидах дают значительный вклад в стэкингвзаимодействия, который, как мы увидим, практически не уве личивается с ростом длины цепи. Далее, решающую роль в опре делении конформации полинуклеотида играют взаимодействия ближайших мономерных единиц, а взаимодействия более далеких единиц можно считать пренебрежимо малыми. Поэтому, напри мер, рассмотрение динуклеозидфосфатов раскрывает основные конформационные особенности однотяжевых полинуклеотидов.
В этом смысле мононуклеотиды и динуклеотиды резко разли чаются: конформационная свобода первых очень велика благода ря возможности вращения вокруг пяти одинарных связей рибозофосфатного «скелета» и гликозидной связи между основанием и фуранозным кольцом; в то же время в динуклеотидах конформа ционная свобода ограничена из-за стремления оснований распо ложиться одно под другим. По этой причине рассмотрение возмож ных конформаций наименьших структурных единиц полинуклео тидов (фрагментов, не превышающих по величине мононуклеотид) еще не приводит к полному пониманию конформаций макромоле кул.
1. СТРУКТУРНЫЕ ЕДИНИЦЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
В нуклеозидах гетероциклическое азотистое основание связано гликозидной связью с углеводным остатком. «Мономерной еди ницей» однотяжевого полинуклеотида является мононуклеотид, т. е. нуклеозид, содержащий фосфатную группу. В зависимости от того, с каким атомом кислорода рибозы или дезоксирибозы —
2', 3' |
или 5'— соединена фосфатная группа, различают несколь |
ко типов |
нуклеотидов |
или нуклеозидфосфатов. |
|
|
|
Основание |
|
|
Основание |
|
|
Основание |
s' |
|
\ / |
Н О С Н 2 о |
|
|
S’ |
\ / |
Н О С Н 2 о |
N ' |
|
(Н О )2Р - - о с н 2 о XN |
|
|
|
к |
' |
|
о |
ГК |
|
у |
' |
|
|
|
| . у |
z’Y |
у |
' |
2'y |
|
у ' |
н о |
|
о - р (о н ) 2 |
(о н ) 2р —о |
о н |
|
н о |
о н |
|
' |
о |
II |
|
|
|
|
|
|
о |
|
|
|
|
|
Конформация мономерной единицы определяется геометрией фуранозного кольца, структурой основания, фосфатной группы и, наконец, относительным положением основания и пятичленного кольца.
Углеводный остаток
Остановимся сначала на конформациях углеводного остатка — 2-дезокси-р-Д-рибозы в ДНК или |3-Д-рибозы в РНКПростран ственная структура 2-дезоксирибозы впервые была грубо опре делена в результате рентгеноструктурного исследования крис талла 5-бромтимидина. Эта структура была единственной, которой мог воспользоваться Спенсер [5] в конце пятидесятых го дов для построения модели, показавшей ряд структурных особен ностей фуранозного кольца. Прежде всего он нашел, что наиболее выгодные конформации соответствуют отклонению атомов С2' и С3< из средней плоскости остальных четырех атомов кольца.
Действительно, как показали более поздние исследования, фуранозное кольцо в нуклеозидах, нуклеотидах и нуклеиновых кис лотах имеет неплоскую конформацию, промежуточную между фор мами конверта (Cs) и полукресла (С2). Однако в отличие от цикло пентана, в котором эти две формы имеют одинаковые энергии, фуранозные кольца явно тяготеют к форме конверта. Ниже схе матически представлены четыре возможные конформации углевод ного кольца: если атом С2- (или С3-) выходит из плоскости Q-OCv в ту сторону, где расположен экзоциклический атом Cs-, то конформация называется эндо-, если в другую сторону, то экзо-.
.г г'
В дальнейшем Сундаралингам и Иенсен [6, 7] классифициро вали конформации рибозы в следующих соединениях, кристалли ческие структуры которых были к тому времени определены: 5-фтордезоксиуридин [9], цитидиловая [8], адениловая [10]итимидиловая кислоты [11], дезоксиаденозин [12]. Как выяснилось, все четыре указанные конформации встречаются в нуклеозидах и ну клеотидах, однако вероятность появления каждой из них неоди накова. Чаще всего наблюдаются э«до-конформации, причем вы ход атома С3' из средней плоскости других четырех атомов коль ца почти столь же вероятен, как и выход атома Сг-. экзо-Конфор мации весьма редки: они были обнаружены только в двух струк турах— дезоксиаденозине [12] и тимидине [13].
Можно ли предсказать равновесные конформации углеводного остатка и оценить относительные энергии эндо- и экзо-форм? Оче видно, что, располагая эмпирическими потенциальными функ циями и пользуясь приемами, описанными в гл. 2, это нетрудно сделать. А. А. Луговской и В. Г. Дашевский 114] рассматривали энергию напряжения p-D-рибозы (или дезоксирибозы) в следую щем виде
^ = 2 £ |
/ М |
+ 4 - с оЬ *о + ~т Сс Ц |
Аас + |
|
i>) |
|
|
|
|
|
|
|
+ |
о + cos3<р<-)+ - Y 2 |
2! о + « |
* + |
|
' =1 |
|
|
|
/= 4 |
|
|
|
|
+ |
1 |
( |
9 |
- |
1 |
) |
|
|
|
*>/ |
|
|
|
|
где f{rtj) — потенциалы невалентных взаимодействий, Да0 — де формация угла СиОС4', Аас — деформации других валентных углов, в вершинах которых лежат атомы углерода; последние вклады соответствуют торсионным напряжениям и кулоновским взаимодействиям.
Конформация пятичленного цикла с жесткими валентными связями, очевидно, может быть полностью описана четырьмя (2п — 6) независимыми параметрами. Выбрав в качестве этих па
раметров углы вращения вокруг связей С—О ( ф 4 и ф 5) |
и два |
валентных угла, авторы построили конформационную |
карту’ |
( ф 4 . фб ). каждая точка которой соответствует минимуму энергии по несущественным параметрам — валентным углам. Эта карта при ведена на рис. 9.1.
Конформации Су-эндо и Су-эндо оказываются в минимумах, причем вторая конформация выгоднее первой на 3,7 ккал/моль. экзо-Конформации расположены на дне оврага потенциальной функции и значительно удалены от минимумов. То обстоятельство, что экзо-конформации все же встречаются в некоторых нуклео зидах, по-видимому, обусловлено межмолекулярными водородны ми связями.
6! 403
Заметим, что формы рибозы, расположенные по дну оврага коиформационной карты (ф4, ср5), существенно неплоские: как показывает расчет, один из атомов углерода (С2или С3') выходит из средней плоскости других четырех атомов на 0,4—0,6 А. Полу чающаяся при этом структура значительно ближе к конверту (Cs), чем к иолукреслу (С2).
Рис. 9.1. Конформационная карта (<р4, ф6) (3-£>-рибозы при оп тимизированных валентных углах.
Значения энергии приведены в ккал/моль. Крестиками указаны коорди наты рибозы в нуклеозидах, нуклеотидах и нуклеиновых кислотах.
Интересно, что все экспериментальные точки, соответствую щие конформациям углеводного кольца в нуклеозидах, нуклеоти дах и нуклеиновых кислотах, расположились по дну оврага. Лишь несколько точек имеют сравнительно большие энергии, однако почти все они относятся к структурам, расшифрованным более 10 лет назад, когда точность определения координат атомов в та ких сложных молекулах была еще недостаточно высокой. Впро чем, вопрос об относительных энергиях конформеров не так прост, ибо электростатические взаимодействия играют здесь далеко не последнюю роль: без учета кулоновских взаимодействий энергии всех эндо- и э/езо-конформаций были бы примерно одинаковыми. Имея в виду, что современные методы расчета электростатической энергии далеки от совершенства, карте на рис. 9.1 следует при давать лишь качественное значение.
Азотистые основания и фосфатные группы
Следующим важным элементом структуры нуклеиновых кислот являются азотистые основания. Во всех рентгеноструктурных ис следованиях пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеино вых кислот отмечается, что атомы, составляющие кольца, лежат приблизительно в одной плоскости (отклонения от средней плоско-
н |
н |
|
|
|
|
|
|
V11,328 |
|
|
|
О |
|
|
|
|
|
11,23% |
М |
|
м |
Н ч |
<*120а^12Во £ |
|
|
113' |
с |
|
|
N |
|
|
120° \5 |
|
|
|
|
о|3127° |
120 |
,5 |
|
1,38/1 |
11,398 |
1.3Щ |
|
|
1,ЗЬ° |
|
^ 1 2 2 °Q m ' |
|
|
|
С 118° |
119 С |
|
|
|
О |
|
|
|
|
'Н |
СГ |
I |
|
f |
| ; |
^ |
|
|
|
|
|
|
|
н |
|
|
|
н |
|
|
|
|
|
цитозин |
|
|
урацил |
|
|
Рис. 9.2. Средние величины длин связей и валентных 'углов гетероцикличе
ских оснований нуклеиновых кислот.
сти находятся в пределах ошибок эксперимента). Однако экзоциклические связи нередко выходят на небольшие углы из этой плос кости. Так, в молекуле аденозин-5'-фосфата [10] плоскость ами ногруппы составляет с основанием угол 25°, атом С5 лежит на 0,043 А ниже, а атом Nx — на 0,051 А выше плоскости основания. Во всех структурах нуклеозидов и нуклеотидов отклонение атома Си углеводного остатка от плоскости основания довольно великопорядка 0,2 А, вследствие чего угол гликозидной связи с плоско стью основания составляет 5—8°.
На рис. 9.2 приведены оценки средних (усредненных по много численным экспериментальным данным) значений длин связей и валентных углов в основаниях [15, с. 167]. Большие расхождения между структурными параметрами, полученными в разных ра
ботах для одного и того же основания, зависят в ряде случаев от того, является ли основание протонированным или непротонированным. Помимо этого определенное влияние на структуру осно вания оказывают и межмолекулярные водородные связи. Тем не менее в расчетах конформаций моно- и полинуклеотидов имеет смысл использовать усредненные величины.
Структура фосфатной группы детально проанализирована в ря де работ ЦБ, 16]. Таким образом, средние значения длин связей и валентных углов в нуклеотидах и соответствующих полимерах известны в настоящее время с достаточно хорошей точностью. На рис. 9.3 приведены структурные параметры нуклеотида, ис пользовавшиеся Арноттом 116] в рентгеноструктурных исследова ниях нуклеиновых кислот. Можно ожидать, что в реальных ну клеотидах и нуклеиновых кислотах отклонения длин связей от значений, указанных на рис. 9.3, не будут превышать 0,02 А, а валентных углов — 1—2°.
О
|
|
Рис. 9.4. |
Нумерация атомов и |
но |
рые валентные углы отрезка полинукле- |
менклатура |
конформацнонных |
уг |
отидной цепи для конформации саха |
лов мономерной единицы полину |
ра С3,-9ндо (для |
С2,-эядо-конформацни |
клеотида. |
|
|
валентные углы |
при С2, должны быть |
|
|
|
вменены на углы приС3, и наоборот).
Разумеется, знание длин связей и валентных углов необхо димо для конформационного анализа полинуклеотидов. Однако существенными параметрами потенциальных функций этих макро молекул являются, как и в случае стереорегулярных полимеров и полипептидов, двугранные углы — углы вращения вокруг оди нарных связей рибознофосфатного скелета, а также угол враще ния вокруг глнкозидной связи.
Арнотт и Хакинс 117] предложили удобную номенклатуру кон формаций полинуклеотидов. На рис. 9.4 приведена мономерная единица полинуклеотида и указаны обозначения углов вращения.
Движение по полинуклеотидной цепи, согласно этой номен клатуре, происходит в направлении от С5' к С3'. Конформационные углы для /-го остатка обозначаются срг-, фг, 0г, | г, <хг, сог. Углы вращения отсчитываются от г^цс-конформаций (аналогично рас смотренной в гл. 7 номенклатуре конформаций стереорегулярных
макромолекул), положительное направление соответствует вра щению по часовой стрелке, угол у отсчитывается от цис-конфор мации связи N4—С2 пиримидина (или N9—С4 пурина) по отноше нию к связи Сг —С2- сахара. Некоторая неоднозначность возни кает в описании конформаций углеводного кольца: если двугран ный угол Сб'С гСз'О обозначить через а, а Сз'С^Сз'Сг' —через о', то а' = 125° + о.
Конформации нуклеозидов
Рассмотрим сначала угол у, характеризующий взаимное положе ние основания и углеводного кольца. Очевидно, если заданы угол у и конформация углеводного кольца, то структуру нуклеозида можно считать полностью определенной. До того, как была пред ложена рассмотренная выше номенклатура конформаций, для описания вращения вокруг гликозидной связи обычно использо вался угол <pCN, введенный Донохью и Трубладом [18] и опреде ляемый как угол, образованный следом плоскости основания и проекцией связи О/ —О рибозы (или дезоксирибозы) на плоскость, перпендикулярную гликозидной связи. Положительные углы от считываются по часовой стрелке, если смотреть вдоль связи Сц—N от Q' к N; (pCN считается равным 0°, когда угол между проекци ями связей Ci— О и N9—С4 в пурине (или N4—С2 в пиримидине) равен 180°. Из рассмотрения молекулярных моделей авторы за ключили, что существуют две предпочтительные области торсион ных углов. Первая — с <pCN, равным —30 ± 45° (анти-область), вторая — с cpCN, равным + 150 ± 45° (спн-область). Например, для аденозина:
н о о н
(Хотя дальнейшее обсуждение будет проведено в терминах (pCN, надо иметь в виду, что cpCN и у связаны простым соотношениемФеи ~ 1 4- 63°, точнее, для Су-зндо-конформации сахара cpCN = = у +64,8°, а для С3'-зядо-конформации cpCN = у +61,6°.
Из рентгеноструктурных данных следует, что в подавляющем большинстве кристаллических нуклеозидов и нуклеотидов основа ния находятся в анпш-ориентации; исключение составляет дезоксигуанозин [19], в котором срем = + 138°. Непосредственные све дения о конформациях нуклеотидов и нуклеозидов в растворемож-
но получить из экспериментов по дисперсии оптического враще ния и спектрам ЯМР высокого разрешения. В частности, в работе [20] было подтверждено, что пиримидиновые мононуклеотиды в растворе находятся в ан/ли-конформации.
Хашемейер и Рич [21] детально исследовали вопрос о двугран ных углах (pCN в нуклеозидах. Предполагалось, что свобода вра щения и разрешенные конформации определяются расстояниями между атомами оснований и углеводного кольца. Области допу стимых значений (f>cN были найдены с использованием условий Рамачандрана. При этом для улучшения согласия между вычи сленными и наблюдаемыми значениями cpCN в ряде случаев при шлось использовать несколько уменьшенные радиусы атомов.
Расчеты показали, что в пиримидиновых нуклеозидах про странственные затруднения при вращении вокруг гликозидных связей возникают в основном из-за взаимодействия боковых групп при углеродных атомах углеводного остатка со связями С2 = 0 и Ctl—Н основания. Вращение в пуриновых нуклеозидах ограни чено возникновением укороченных контактов с атомом N3 шести членного кольца. Однако при использовании уменьшенных ван- дер-ваальсовых радиусов cpCN может принимать любые значения, лежащие в пределах между син- и ан/лы-конформациями.
В работах [22, р. 77; 23, 24] энергия вращения вокруг гликозидной связи вычислялась с использованием потенциалов нева лентных взаимодействий. При этом было показано, что для уридина, цитидина и аденозина ан/ли-конформации являются самыми выгодными; в гуанозине наиболее устойчива слн-конформация. Согласно работе [22], разность энергий между син- и анти-кон- формациями для аденозина и гуанозина составляет 1—2 ккал/моль, а для уриднна и цитидина — 5—7 ккал/моль. Таким образом, пи римидиновые нуклеозиды и нуклеотиды обычно имеют анти-кон- формацию, а пуриновые — как син-, так и анти-. На рис. 9.5 по казаны потенциальные функции вращения вокруг гликозидной связи для тех конформаций рибозы, которые наблюдались в со ответствующих нуклеозидах (расчеты проводились с потенциала ми Дашсвского).
Интересно, что энергия электростатических взаимодействий практически не оказывает влияния на ход кривых, и потому не определенности, связанные с параметризацией (монопольным при ближением и зарядами, вычисленными по методу Дель Ре), не столь существенны. Более подробный анализ потенциалов вращения для различных конформаций сахарного кольца имеется в работе
[23].
Все изложенные результаты по конформациям нуклеозидов были получены в предположении, что рибоза или дезоксирибоза имеют фиксированные координаты атомов. Однако нельзя думать что при поворотах основания вокруг гликозидной связи углы вра щения фуранозного кольца останутся неизменными. В связи с этим А. А. Луговской, В. Г. Дашевский и А. И. Китайгородский
i25] исследовали проблему конформаций нуклеозидов с гибким фуранозным кольцом. Хотя основные выводы относительно раз решенных областей <pCN в этом случае меняются мало, интересно, что между конформацией сахара и положением основания (син или анти-) имеется определенная корреляция.
Рис. 9.5. Потенциальные [функции |
вращения вокруг гликозидной связи в |
иуклеозидах: |
|
а — гуаиозин; б — аденозин; (сплошная |
кривая — атом N 3 отстоит от плоскости угле» |
о |
|
водного кольца на 0,2 А, штрихпунктирная кривая — плоское расположение валентны* связей атома N, участвующего в образовании гликозидной связи, пунктирная кривая — расчет с учетом электростатических взаимодействий); в — уридин; г — цитидин.
Конформации мономерной единицы попинуклеотидной цепи
Рассмотрим возможные конформации фрагментов полинуклеотидной цепи, считая вращение вокруг гликозидной связи и двугран ные углы в рибозофосфатном скелете независимыми. На рис. 9.6 показан фрагмент, детально исследованный методом жестких сфер Рамачандраном и сотр. [26, v. 2, р. 641] (этот фрагмент несколько отличается от мономерной единицы, предложенной Арноттом и Хакинсом, см. рис. 9.4). Необходимо отметить, что для полного описания конформации нуклеозид-З'-фосфата необходимы сведе ния об угле ф, а для нуклеозид-5'-фосфата — об угле ф. Однако поскольку вращения, по крайней мере, с той точностью, которую дает метод жестких сфер, не коррелированы, а ф и ф не играют большой роли в случае мономерной единицы цепи, можно считать, что рассмотрение этого фрагмента дает информацию о разрешен ных и запрещенных областях для мононуклеотидов.
Для нахождения разрешенных конформаций каждое вращение представляется матрицей, и координаты атомов ротаметра вычи сляются по методике, описанной в разделе 5 гл. 2. Включение в расчет атомов водорода оказывает заметное влияние на разрешен ные области. В то же время существенно, что введение пуриново го или пиримидинового основания практически не изменяет конформационной свободы фрагментов, откуда следует независимость углов вращения в рибозофосфатном скелете и угла <pCN (или х). Возможные конформации характеризуются следующим набором торсионных углов: 0 около 180°, £ около 60°, 180° и 300°, со в пре делах от 210° до 260°.
Индийские авторы [27] провели конформационный анализ ука занного фрагмента с использованием атом-атом потенциалов. Они
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
построили |
кривые |
зависимости |
|
|
Уф f |
в |
|
|
|
энергии от каждого из углов вра |
н о — р - е - о - е - с н |
|
|
щения (0, |
| и со) при фиксирован |
|
|
II |
S |
t r > |
Г |
ных |
значениях |
других |
углов; |
|
|
о |
|
помимо |
этого были |
построены |
|
|
|
|
двумерные конформационные кар |
|
|
|
|
4о |
о н |
ты (г|э, 0) |
и (0, |
£). |
Важно отме |
|
|
|
|
|
|
|
тить, что |
рассматриваемый фраг |
|
|
|
|
|
|
|
мент имеет довольно много мини |
|
|
|
|
|
|
|
мумов: так, на |
карте (ф, 0) |
Рис. |
9.6. |
Рнбозофосфатиая |
|
еди- |
имеется |
девять |
минимумов, раз |
ница |
в |
конформационных |
пара- |
личающихся по энергии не более |
метрах 0, |
£ и |
и. |
|
|
|
чем на |
1 ккал/моль, |
а |
на карте |
|
|
|
|
|
|
|
(0, |
£) — четыре. |
Таким |
образом, |
поиск глобального экстремума потенциальной энергии фрагмен та, показанного на рис. 9.6,— задача далеко не тривиальная, не говоря уже о том, что выбор его в значительной степени опреде ляется параметризацией.
В регулярном однотяжевом полимере (например, поли-А) рибознофосфатный стержень содержит уже пять независимых пара метров, т. е. в дополнение к рассмотренным выше углам необхо димо включить еще ср и ф. Углы ср и ф появляются только в динуклеозидфосфатах, и по этой причине разрешенные конформа ции макромолекулы могут быть найдены из |рассмотрения динуклеозидфосфатов (с аналогичной ситуацией мы встречаемся при исследовании олиго- и полипептидов — все основные закономер ности следуют из анализа конформационных карт дипептидов).
Индийские авторы [28] исследовали методом атом-атом потен циалов конформации динуклеозидфосфата, представляющего со бой два нуклеозидных остатка, соединенные фосфорноэфирными свя зями. Конформационная карта (ср, ф), согласно их расчету, имеет семь сравнимых по глубине минимумов, причем выбор глобаль ного минимума практически полностью определяется параметри зацией— выбором парциальных зарядов, постоянной е и «имма нентных» потенциалов связей Р—О. Можно только сказать, что
