книги из ГПНТБ / Дашевский, В. Г. Конформации органических молекул

Успех предсказания типа спирали того или иного полипепти­ да в значительной степени определяется параметризацией и, в частности, предположениями, принятыми относительно электро­ статических взаимодействий. Шерага и сотр. [12, 72, 73], проведя расчеты конформаций различных полипептидов, в подавляющем большинстве случаев правильно предсказали тип и знак спирали и тем самым продемонстрировали адекватность принятой ими па­ раметризации.

Межмолекулярные взаимодействия в полипептидах и структура фибриллярных белков

Структура полипептидов в кристаллах и растворах может опре­ деляться не только внутримолекулярными взаимодействиями. Межмолекулярные водородные связи между цепями часто при­ водят к стабилизации конформации цепи, которая была бы невы­ годна для изолированной макромолекулы. Классическим приме­ ром является (1-структура полипептидов, которая на многих конформационных картах проигрывает а-спирали, однако в отличие от последней стабилизируется межмолекулярными водородными связями. Помимо этого, межмолекулярные взаимодействия могут приводить и к стабилизаций многотяжевых комплексов, харак­ терных для многих синтетических полипептидов и фибриллярных белков.

Расчет конформации полипептида в кристалле, строго гово­ ря, должен проводиться методом, описанным в разделе 6 гл. 3, т. е. необходимо найти минимум энергии молекулы и кристалли­ ческой решетки по параметрам, описывающим конформацию, и параметры элементарной ячейки. Такая процедура была примене­ на Шерага и сотр. [74] к расчетам кристаллической структуры поли-Т-аланина и поли-(1-бензин-/.-аспартата. Что касается (5- структуры поли-/,-аланина, то расчеты показали, что межмоле­ кулярные взаимодействия практически не сказываются на кон­ формации, т. е. для этой молекулы можно было бы сначала найти оптимальную конформацию, затем упаковать жесткие полипептидные цепи в соответствующем кристалле. Однако для со-спирали поли-(5-бензил-/.-аспартата такой способ действий не привел бы к успеху, поскольку конформация этой макромолекулы зависит от межмолекулярных взаимодействий, главным образом от взаи­ модействий боковых цепей. В этом случае только полное решение задачи конформация — упаковка дает сопоставимые с опытом ре зультаты.

Межмолекулярные взаимодействия играют большую роль в определении структуры фибриллярных белков — белков, состав­ ляющих основу костных и мышечных тканей. В зависимости от конформации фибриллярные белки могут быть разделены на три класса: (1) белки, состоящие из «спиральных спиралей» (а-форма

381

кератина, мышечный белок миозин); (2) белки, содержащие слоис­ тые {J-структуры (Р-кератин, шелк); (3) белки типа коллагена — тройные спирали, не образующие «сверхспиралей» и, следователь­ но, имеющие независимые углы вращения в отличие от белков класса (1). Достаточно очевидно, что существование многотяже­ вых спиралей и слоистых P-структур возможно именно благодаря межмолекулярным взаимодействиям, и конформационный анализ, ставящий цель найти углы <р и ф в фибриллярных белках, непре­ менно должен учитывать это обстоятельство.

Рентгеноструктурный анализ фибриллярных белков [75, р. 3; 76, р. 603; 77] дает картину, весьма бедную рефлексами, вследствие чего прямое определение структуры Фурье-синтезом и постро­ ением карт электронной плотности становится невозможным. Вместо этого из рентгенограмм волокна определяют проекцию мономерной единицы на ось спирали (d) и угол спирального вра­ щения (6). Этих данных, разумеется, недостаточно для нахожде­ ния всех углов ф и ф (а иногда и х). и можно надеяться, что кон­ формационный анализ станет важным вспомогательным инстру­ ментом при расшифровке структуры, подобно тому, как это уже делается для синтетических макромолекул в кристаллах. Действи­ тельно, если из расчета конформаций удастся получить все углы Ф, ф и х. то тогда нетрудно будет вычислить координаты атомов и сравнить теоретическое распределение интенсивности рентгено­ грамм с экспериментальным.

Остановимся на конформациях фибриллярных белков трех указанных выше классов.

Рентгенограммы волокна а-кератина показывают, что этот бе­ лок не может состоять из параллельных а-спиралей, и наилучшее согласие с распределением рефлексов получается, если принять, что а-спирали скручены одна с другой, а возможно, и с третьей и образуют сверхспираль [78, 79]. Сколько а-спиралей скручено друг с другом, пока еще не удалось точно установить. Ряд иссле­ дователей утверждает, что для а-кератина наиболее вероятна тройная сверхспираль [80], тогда как для парамиозина двойная спираль приводит к лучшему согласию с распределением интен­ сивности рентгенограмм 181]. Исследование, проведенное в работе [82], дает основание считать, что миозин, а-кератин и тропомиозин в сухом состоянии, так же как и парамиозин, с наибольшей вероятностью имеют двойную сверхспираль. Интересно, что не­ которые типы шелка имеют четверную сверхспираль, состоящую

из а-спиралей 1831.

Парри и Сузуки [84, 85], рассчитав энергию упаковки однотя­ жевых а-спиралей и энергию сверхспиралей, нашли, что двухтрех- и четырехтяжевые комплексы выгоднее простых а-спиралей (при этом параметры сверхспиралей были заданы в соответствии с данными рентгеноструктурного эксперимента). Полученный ре­ зультат, конечно, очень интересен, поскольку он объясняет ста­ бильность а-спиральных фибриллярных белков, однако более нер-

382

спективным представляется не просто построение многотяжевых спиралей, а поиск минимума энергии по внутри- и межмолекуляр­ ным геометрическим параметрам.

Фиброин шелка, состоящий из остатков глицина, аланина и небольшого количества остатков серина, существует в виде антипараллельных ^-структур, скрепленных между собой водород­ ными связями [86, 87, v. 4, р. 397]; из смеси параллельных и антипараллельных (5-структур состоит (5-кератин [88]. Некоторые виды шелка и кератина содержат «кросс-р-форму» [891, для которой долгое время оставалась непонятной геометрия в складках, и лишь работа [90] прояснила ситуацию.

Коллаген и родственные коллагену полипептиды относятся к третьему классу фибриллярных белков и, как было показано Рамачандраном и Карта [91], имеют структуру тройной спирали. Син­ тетические полипептиды с последовательностями остатков, моде­ лирующими коллаген (один остаток аминона два остатка иминокислот), на протяжении многих лет изучаются в лаборатории Н. С. Андреевой [92, 93; 94, р. 173; 95, v. 1, р. 291]. Н. Г. Есипова и Н. С. Андреева [92, 95] установили, что большую роль в стаби­ лизации структур типа коллагена играют молекулы воды. Так, при понижении влажности молекулы воды, выходя из тройной спирали, заставляют полипептид принять иную конформацию (воз­ можно, именно с этим связаны вопросы старения организмов).

Расчеты конформаций полипептидов, моделирующих коллаген, проводились Хопфингером и Уолтоном [96] и В. Г. Туманяном [97]. Последний, рассмотрев последовательность G1у—Pro—Pro, нашел пять минимумов потенциальной поверхности тройной спирали (составленной из этой трипептидной последователь­ ности), причем большинство из полученных им структур близ­ ки к структурам, предложенным на основании анализа рентгено­ грамм полимеров этого типа [98, 99; 100, v. 1, р. 132; 101]. Сейчас еще трудно сказать, дискретны ли эти конформации, каковы барь­ еры, разделяющие минимумы и удобны ли найденные структуры для посадки молекул воды. Ответ на эти вопросы потребует новых расчетов, для чего необходимы лишь искусство программирова­ ния и машинное время.

Конформации олигопептидов

Многие природные и синтетические гормоны представляют собой молекулы, состоящие из относительно небольшого числа амино­ кислотных остатков (в среднем порядка 10). Естественно предпо­ ложить, что биологические функции, хотя бы некоторых из них, определенным образом связаны с конформациями, и, следователь­ но, конформационный анализ молекул такого типа должен иметь познавательное значение. Однако найти минимум энергии даже сравнительно небольшого олигопептида — задача более сложная чем предсказать структуру многотяжевой спирали. Основной трудностью, лежащей на пути расчетов конформаций нерегуляр­

383

ных олигопептидов, является проблема многих минимумов, и в этом смысле олигопептиды являются «маленькими белками». Дей­ ствительно, если каждый аминокислотный остаток («пептидная единица») может иметь три конформации R, В и L, то в декапепти­ де возможно уже З10 конформаций. В циклических пептидах бла­ годаря условиям замыкания число возможностей несколько мень­ ше; гораздо меньше оно для симметричных циклических пептидов, и потому в ряде случаев поиск оптимальной структуры становится технически выполнимым.

Рассмотрим в качестве примера весьма сложный депсипептидный цикл — энниатин В, являющийся переносчиком ионов че­ рез мембраны.

В работе [102] было экспериментально установлено, что молекула этого «шестизвенного» цикла может иметь, в зависимости от поляр­ ности среды, две конформации — «неполярную» N и «полярную» Р. Расчеты конформаций однозначно предсказывают эти две струк­ туры и помогают объяснить большой экспериментальный материал по этому соединению (в частности, спектры ЯМР).

Конформационные карты Ы-ацетил-К-метил-Двалина и диметиламида О-ацетил-ДДоксиизовалериановой кислоты, модели­ рующих два фрагмента энниатина В, приведены на рис. 8.12 а и б соответственно. Как видим, первый фрагмент может иметь четы­ ре конформации приблизительно равной энергии, тогда как вто­ рой фрагмент — только одну. Для поиска оптимальных конфор­ маций всей молекулы энниатина В вовсе не обязательно миними­ зировать потенциальную функцию по многим переменным — достаточно собрать скелетные модели с разрешенными конформация­ ми (комбинации из четырех конформаций первого фрагмента и од­ ной конформации второго фрагмента). Рассмотрение моделей пока­ зывает, что молекула действительно может иметь две конформа­ ции, если шестизвенный цикл замкнут. Одна из них — «поляр­ ная» форма — показана ниже вместе с ионом К+, входящим в по­ лость молекулы и образующим координационные связи с атомами кислорода.

384

О— атомы углерода 0 —атомы кислорода

Если ионы калия отсутствуют, молекула энниатина В перехо­ дит в другую конформацию — «неполярную». Таким образом, рас­ четы и экспериментальные данные (на последних мы не остана­ вливаемся) показывают, что в основе механизма переноса ионов этими молекулами лежат конформационные перестройки.

Рис. 8.12. Конформационные карты Ы-ацетил-Ы-метил-/.-валина (а) и диметиламида 0-ацетил-0£-оксиизовалериановой кислоты (б) — моделей фраг­ ментов молекулы энниатина В

И все же успешное предсказание структуры энниатина В яв­ ляется скорее исключением, чем правилом. Трудности, с которыми сталкиваются теоретики при решении многоэкстремальных задач, хорошо видны на примере циклического симметричного декапеп­ тида грамицидина С

L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe —L-Pro

L-Pro—D-Phe—L-Leu—L-Om — L-Val

Рентгеноструктурное исследование этой молекулы [103] пока­ зало наличие оси симметрии второго порядка. Хотя полностью расшифровать структуру не удалось, авторы этого исследования предложили пространственную модель грамицидина С. Десятиле­ тием позже Ликвори [104] и Шерага 113, 14] нашли пространствен­ ные модели, удовлетворяющие критерию допустимых контактов, причем Шерага делал выбор из 282 различных конформаций, ми­ нимизируя потенциальную функцию. Однако все три предложен­ ные структуры не удовлетворяли некоторым косвенным экспери­ ментальным данным [105]. В связи с этим было рассмотрено еще несколько моделей пространственной структуры грамицидина С [106, 107J. И все же до настоящего времени конформацию этой мо­ лекулы пока еще нельзя считать окончательно выясненной, хотя наиболее вероятной представляется структура, стабилизируемая двумя водородными связями между группами С = 0 и N—Н остат­ ков валина и лейцина [1081.

Итак, для предсказания конформации нерегулярного олиго­ пептида требуется найти абсолютный минимум функции многих переменных, что само по себе является весьма трудной задачей (см. раздел 5 гл. 2). Далее, надо иметь в виду, что в выборе опти­ мальной структуры играет роль не только глубина ямы, но и ее форма. В самом деле, оптимальная структура определяется ми­ нимумом свободной энергии, а не энтальпии, а форма ямы дает энтропийную часть свободной энергии.

Однако и в том случае, если нам удастся найти несколько луч­ ших вариантов, нелегкой останется проблема относительной ста­ бильности различных конформаций. Как мы уже видели, погреш­ ность в вычислении относительной стабильности, обусловленная несовершенством приближений и параметризации, вполне может достигать 0,5 ккал/моль на пептидную единицу, что дает на всю молекулу декапептида 5 ккал/моль и может затруднить выбор оптимальной структуры. Поэтому вполне вероятно, что решение задачи о конформациях средних по размеру олигопептидов ока­ жется не легче, а труднее, чем предсказание структуры глобуляр­ ного белка, ибо для белков можно найти некоторые общие прин­ ципы.

4. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

Конформации дипептидных фрагментов

вбелках

Вразделе 2 этой главы мы достаточно подробно останавлива­ лись на конформации моделей дипептидов именно потому, что их конформационные карты дают возможность проанализировать дву­ гранные углы в глобулярных белках, пространственная структура которых определена методом рентгеноструктурного анализа. По­

386

добный анализ был проведен Брантом и Шиммелем [109], Рамачандраном 116], Шерага [17] и другими авторами.

На рис. 8.13 показаны конформационные карты метиламида N-ацетилаланина с нанесенными на них точками, соответствую­ щими углам вращения в миоглобине кашалота [ПО, 111] и лизо­ циме яичного белка [112, 113]. Понятно, что для подобного анали­ за аланин является наиболее подходящим остатком, поскольку он моделирует все другие остатки, содержащие атом Ср. Карты

Рис. 8.13. Конформационные карты метиламида Ы-ацетил-/.-аланина с на­ несенными на них точками, соответствующими углам <р и ф в неспиральных участках миглобина кашалота (а) и лизоцима яичного белка (б). Кружки соответствуют остаткам глицина.

на рис. 8. 13 построены с потенциалами Дашевского без учета элек­ тростатических взаимодействий и водородных связей. Действи­ тельно, эти взаимодействия несущественны для понимания кон­ формаций дипептидных фрагментов в белках: электростатические взаимодействия сказываются лишь на относительной стабильно­ сти конформеров и в значительной степени зависят от природы бо­ кового радикала R, а водородные связи, стабилизирующие свер­ нутые формы дипептидов, встречаются в глобулярных белках край­ не редко; они возможны лишь в участках, ответственных за пово­ роты полипептидной цепи. Наконец, следует заметить, что точки, соответствующие спиральным участкам белков, очевидно, не имеет смысла наносить на карты, поскольку все они должны оказаться в благоприятных областях.

Как видно из рис. 8.13а, все точки миоглобина попадают в об­ ласти низких энергий — до 2 ккал/моль. В лизоциме, как было указано в работе [108], 18 остатков оказываются в неблагоприят­ ных областях. Из них пять остатков глицина (кружки на

рис. 8.136), которые на карте метиламида N-ацетилглицина на­ ходились бы в пределах контура 1 ккал/моль. Далее, конформа­ ции большого числа остатков попадают в область перешейка меж­ ду формами R и В, т. е. эти конформации проигрывают оптималь­ ным примерно 1,5 ккал/моль. Однако конформационный анализ трипептидных фрагментов П14, 1151 показывает, что подобные конформации могут стабилизироваться за счет образования водо­ родных связей между первым и третьим пептидными звеньями. При этом вместо семичленных «циклических» структур, характер­ ных для свернутых форм дипептидов, здесь уже возникают деся­ тичленные «циклы». Но если семичленные «циклы» в белках крайне редки, то трипептидные десятичленные циклы удовлетво­ ряют всем стереохимическим условиям и действительно часто наблюдаются.

Таким образом, конформационная карта метиламида N-ацетил- аланина превосходно объясняет распределение точек (ф, ф) в глобулярных белках. Однако конформационный анализ таких ма­ лых фрагментов, как дипептиды, полезен для объяснения конфор­ маций пептидных звеньев в белках, но явно недостаточен для их предсказания. Теперь мы обратим внимание на те соображения и конформационные расчеты, которые могут быть положены в осно­ ву предсказаний.

Уже давно высказывалось мнение, что первичная структура белка — аминокислотный состав — определяет его пространст­ венную структуру [116, 117). Поскольку за последнее десятилетие структура пяти белков — гемоглобина [1181, миоглобина [ПО, 1111, лизоцима [112, 113], а-химотрипсина [119] и рибонуклеазы А [120] — стала известна детально, а еще для нескольких белков рентгеноструктурный анализ дал достаточное разрешение для то­ го, чтобы увидеть основные черты вторичной и третичной струк­ тур, многие исследователи пытаются найти корреляцию между аминокислотным кодом (составом и последовательностью амино­ кислотных остатков) и конформационным кодом (пространствен­ ной структурой).

Поиски корреляций связаны с тем обстоятельством, что полное предсказание пространственной структуры белка по его амино­ кислотной последовательности сопряжено с неопределимыми в на­ стоящее время трудностями. Поэтому представляется полезным выявить некоторые детали пространственной структуры белка, ос­ нованные на его аминокислотном коде. Большой интерес пред­ ставляет теоретическая оценка процента спиральности, а также выделение спиральных и неспиральных участков. Можно надеять­ ся, что в будущем такой подход приведет к предсказанию конформационной структуры белков с большим содержанием а- или |3- спиральных участков. Тогда задачу предсказания структуры бел­ ка можно разбить на два этапа: на первом этапе определяются спиральные и неспиральные участки, а затем подбираются такие взаимные расположения спиральных и неспиральных участков.

388

которые дают минимум энергии для белка со сформировавшейся вторичной структурой.

Для предсказания вторичной структуры естественно восполь­ зоваться известными уже структурами белков.' Зная, какие остат­ ки входят в спиральные и неспиральные участки и обработав име­ ющийся структурный материал, можно получить некоторые коли­ чественные характеристики, показывающие способность отдель­ ных остатков или их комбинаций создавать или разрушать ре­ гулярные участки вторичной структуры; в дальнейшем получен­ ные цифры можно применить для предсказания вторичной струк­ туры других белков.

Статистический подход

В некоторых работах [121—125] на основании результатов экспе­ римента или статистической обработки данных по простран­ ственной структуре белков были выделены «спиральные» и «антиспиральные» аминокислотные остатки. Например, в работе [121] было показано, что остатки пролина, рассеянные случайным образом по полипептиду, полностью разрушают спираль, если со­ держание пролина достигнет 8%; в работе [122] на основании экспериментальных данных были выделены антиспиральные остат­ ки — Ser, Tre, Val, Не и Cys. В работе 11241из статистических рас­ четов миоглобина кашалота, а- и [5-цепей гемоглобина лошади и лизоцима яичного белка были выделены в качестве спиральных остатков остатки Ala, Leu, Val, а в качестве антцспиральны-х — остатки Arg, Asp—NH2, Pro. О. Б. Птицын 1125] провел статисти­ ческие расчеты по 6 белкам, т. е. приблизительно по 1000 амино­ кислотным остаткам: помимо тех белков, которые рассматривал Кук, были включены рибонуклеаза и а-химотрипсин. В резуль­ тате были выделены спиральные остатки Leu, Ala, Glu и антиспи­ ральные Tre, Asp—NH2, причем «выбрасывание» из расчета двух гомологичных белков — глобинов — не повлияло на результаты.

Имеется ряд работ, в которых были введены более сложные критерии для нахождения спиральных и неспиральных участков в белках. Итальянские авторы [126] вводят для каждого остатка (учитывая особенности окружения) так называемые спиральные потенциалы. Статистика, учитывающая способность как отдель­ ных остатков, так и их комбинаций образовывать спирали, разви­ та в работах [127—130]. Например, Протеро [127] выдвинул пра­ вило, согласно которому любой участок нолипептидной цепи из пяти аминокислот будет спиральным, если три остатка в нем —

Ala, Val, Leu или Glu.

К сожалению, результаты, которые получаются из статисти­ ческой обработки по нескольким белкам, вряд ли можно признать удовлетворительными. Во всяком случае, все теории предсказы­ вают большой процент спиральности для химотрипсина, хотя в нем содержание спирали составляет всего 4%. Еще хуже обстоит

389

дело с предсказанием p-структур — для них почти не видно ни­ каких закономерностей*. Наверно, это объясняется тем, что, вопервых, экспериментальных данных для хорошей статистики еще мало и, во-вторых, во все расчеты, по которым вырабатываются критерии, с большим весом входят гомологичные белки — гло­ бины, для которых установлена пространственная структура.

Взаимодействие ближайших структурных единиц и их роль в формировании пространственной структуры белка

Кроме статистического подхода, для тех же целей нахождения спиральных и неспиральных участков может быть применен под­ ход, основанный на атом-атом потенциалах. Для этого естествен­ но рассмотреть взаимодействия ближайших структурных единиц: эти взаимодействия проявляются либо в дипептидах, либо в дру­ гих фрагментах, из которых строятся белки.

Котельчук и Шерага [131] рассмотрели «нестандартные» фраг­ менты полипептидной цепи

в которых существенными параметрами являются углы вращения Ф и ф. Расчеты таких фрагментов дают важную информацию о взаимодействии боковых радикалов R' и R" и их взаимодействии с пептидной цепью. Основной вывод, который был сделан из рас­ четов с разными R' и R ", состоит в том, что конформация этого фрагмента зависит только от природы R' и не зависит от R".

Расчеты проводились следующим образом. Для разных ком­ бинаций R' и R" вычислялась потенциальная функция, в которую входили невалентные и электростатические взаимодействия, тор­ сионные потенциалы (взаимодействия С“ ... СД, для экономии

машинного времени включались в торсионный потенциал) и энер­

цепи. Оказалось, что если R" заменить или отбросить совсем, то характер оптимальной конформации фрагмента не изменится.

По тому, которая из трех конформаций этого фрагмента — R, В или L — соответствует самому глубокому минимуму, все ами­ нокислотные остатки можно разбить на две группы — спиральные

* Критерии образования ^-структурных участков сформулированы недавно А. В. Финкельштейном и О. Б. Птицыным [141].

390