книги из ГПНТБ / Методики постановки опытов и исследований по молочному хозяйству [сборник]

Среднее содержание в молоке азота казеина равно 0,417% с колебаниями от 0,362 до 0,518%.

Азот растворимых белков. Содержание азота альбумина и глобулина молока N2 определяют по разности между количе­ ством неказеинового азота Nj и небелкового азота NH.

n 2 = n , - n h .

Пр и ме р . Если неказеинового азота в молоке содержится

0,124%, а небелкового — 0,0251, то N2 будет 0,124—0,0251 = = 0,099%.

Среднее содержание азота растворимых белков равно

0,091% с колебаниями от 0,068 до 0,117%.

П р и б о р ы и р е а к т и в ы : аппарат для отгонки аммиа­ ка, колбы Кьельдаля на 50, 100, 250 мл, селен металлический, серная кислота (удельный вес 1,84), индикатор Ташира, 40%-ный раствор едкого натрия, 0,01 н. раствор едкого натрия, 0 ,0 1 н. раствор серной кислоты, 18%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, 10%-ный раствор уксусной кислоты, 0,25 н. раствор уксуснокислого натрия.

Приготовление индикатора Ташира. Приготавливают два раствора: 1) 0 , 1 % - н ы й спиртовой раствор метилрота красного. Для этого в мерной колбе на 100 мл в этиловом спирте рас- TBqpniOT 1 0 0 мг метилрота, 2 ) 0 , 1 % - н ы й спиртовой раствор метиленовой сини ( 1 0 0 мг сини растворяют в этиловом спирте).

80

Далее 40 мл 0,1%-ного раствора метил;рота смешивают с 10 мл 0 ,1 %-ного раствора метиленовой сини. Из полученной смеси приготавливают рабочий раствор путем добавления к 25 мл смеси 50 мл дистиллированной воды и 25 мл этилового спирта.

Определение количества белков (общий белок, казеин и альбумин + глобулин)

Общее количество белков определяют путем умножения ко­ личества белковых веществ Ng на коэффициент 6,38, который

ножения количества азота, содержащегося в этих белках, на

а растворимых 0,63%, то количество казеина Б 1С= 3,18—0,63 = = 2,55%.

Количество казеина можно определить умножением азота казеина на 6,38.

Пр и ме р . Если азот казеина в молоке составляет 0,400%, то содержание белка казеина — 0,400-6,38 = 2,55%.

Содержание отдельных фракций белков в молоке равно

(в %):_________________________________________________

Разделение белков молока на фракции методом электрофореза

Под действием электрического тока белки разделяются на отдельные фракции благодаря их неодинаковой скорости дви­ жения на хроматографической бумаге. Фракции в виде пятен окрашиваются и колориметрируются.

Водорастворимые белки. В химический стакан емкостью 1 л отмеривают 0,5 л обезжиренного молока (обрата), нагрето­ го до 30°. Казеин осаждают 1 и. раствором уксусной кислоты, которую добавляют постепенно до полного осаждения белков, образования четких хлопьев. Сыворотку отделяют фильтра­ цией через складчатый фильтр. С помощью 1 н. раствора NH4OH pH доводят до 6,5. Этот процесс проводят в отдельной пробе при универсальном индикаторе. При окончании нейтра­ лизации появляется лимонно-желтая окраска со слабо-зелено­ ватым оттенком.

В последующем для осаждения (высаливания) сывороточ­ ных белков в сыворотку вносят кристаллический сульфат ам­ мония из расчета 70 г на 100 мл.

Рис. 10. Горизонтальная камера для электрофореза белков молока на бумаге:

1 — стеклянные плечики для подвешивания бумаги; 2 — кюветы для вероналового буфера; 3 — кюветы для электродов; 4 — электроды

82

веты с электродами соединяют перемычкой из фильтроваль­ ной бумаги с кюветами, где помещены полоски бумаги. На дно камеры между кюветами наливают дистиллированную воду (для насыщения камеры парами). На стартовую линию по­ лоски бумаги, помещенной в камеру, в одну точку наносят фильтрат в количестве 3—4 капель при Помощи пипетки. Ка­ меру закрывают крышкой и включают ток.

В горизонтальной камере электрофорез проводят при на­ пряжении 180—190 в переменного тока в течение 18 час. Сила тока не должна превышать 0,5—0,7 миллиампер на каждую полоску бумаги.

По истечении времени ток выключают, а полоски бумаги на плечиках переносят в сушильный шкаф при 105° на 15—20 мин.

Сухие фореграммы помещают в эмалированную ванночку с раствором бромфенолблау на 10—20 мин. Затем их промы­ вают 5— 6 раз 2%-ным раствором уксусной кислоты, пока жидкость и свободные от белков участки бумаги не станут бесцветными. Фореграммы высушивают при 105°. Чтобы участ­ ки белковых фракций, окрашенные бромфенолблау, были четкими, фореграмму держат несколько секунд над аммиаком.

Для определения фракций сывороточных белков участки фореграммы, занятые отдельными фракциями, вырезают. Кроме того, вырезают такой же площади и свободный участок фореграммы для холостой пробы.

Каждый вырезанный участок измельчают, помещают в про­ бирку, заливают 15 мл 0,01 и. NaOH и через каждый 15 мин. жидкость в пробирках осторожно перемешивают. Элюация продолжается в течение часа, раствор приобретает синий цвет. Затем приступают к колориметрированию (определению экстинкции) на приборе ФЭК-М при нейтральном светофильтре. При этом обычно используют 30 мм кюветы.

В сывороточных белках в порядке возрастания от старто­ вой черты будут следующие фракции: иммунные глобулины, а-лактоальбумин, р-лактоглобулин и сывороточный альбумин. Расположение фракций представлено на рис. 11.

Пр и м е р .

Сывороточные белки молока коров

а-лактоальбумин............................ 0,676 Р-лактоглобулин............................. 1.150

84

Если сумму отсчетов экстинкции принять за 100, то содержание отдельных фракций выразится:

мин составит 28,35%. 13-лактоглобулин — 48,19 и, наконец, сывороточный альбумин — 6,17%.

Рис. 12. Кривая электрофореграммы сывороточных белков

Соотношение фракций в сывороточных белках (в %) со­ ставляет:

Построение кривой по фракциям белка. Фореграмму де­ лят на участки шириной 0,5 см и нумеруют влево от старто­ вой черты со знаком минус, вправо — со знаком плюс. Берут полоску шириной 0,5 см из свободного участка фореграммы, которая является холостой для всех исследуемых фракций.,

85

несколько секунд, чтобы раствор переместился на полоску бу­ маги.

На основании данных отсчета экстинкций устанавливают соотношение отдельных фракций в казеине.

Пр и ме р . При колориметрировании участков форепраммы получены следующие отсчеты экстинкций: для а-казеина—

0,500; й-казеина — 0,830; у-казеина — 0,880 итого— 1,410.

= 35,6%; (3-казеин — 59,0; у-казеин — 5,4%.

По данным исследований, в казеине содержится (в %):

ка, фотоэлектроколориметр ФЭК-М, сушильный шкаф, водо­ струйный насос, эмалированная ванночка, картон Зейца, хро­ матографическая бумага (марки М), целлофан, пипетки на 1, 10 и 50 мл, микропипетка на 0,2 мл.

Установка для электрофореза белков молока (рис. 13). Го­ ризонтальная камера из органического стекла (высота 10,5 см, ширина 32, длина 37 см) должна иметь: стеклянные плечики для подвешивания бумаги, кюветы для вероналового буфера, кюветы для электродов, электроды.

~(Z7- 2B>

□

Рис. 13. Схема установки для электрофореза белков молока:

1 — стабилизатор напряжения; 2 — кенотрон­ ный выпрямитель; 3 — миллиамперметр; 4 — реостат; 5 — камера

87

Кенотронный выпрямитель — источник постоянного тока, изготовленный заводом «Электродело». Он дает выпрямлен­ ное напряжение до 320 в. Предельно допустимая нагрузка 125 миллиампер. Один кенотронный выпрямитель может быть использован для питания нескольких камер.

Вольтметр постоянного тока( класса 0,5) для контроля на­ пряжения на электродах; миллиамперметр для измерения си­ лы тока включается в цепь последовательно с камерой для электрофореза.

Ре а к т и в ы . 2%-ный раствор уксусной кислоты, 1 н. рас­ твор аммиака, 10%-ный хлористый барий, универсальный ин­ дикатор, 0,01 н. раствор едкого натрия, сульфат аммония (кристаллический), бромфенолблау, вероналовый буфер, медииал, сулема (кристаллическая).

П р и г о т о в л е н и е р е а к т и в о в . Бромфенолблау (кра­ ситель). В 1 л 2%-ного раствора уксусной кислоты при слабом напревании растворяют 1 г бромфенолблау и 10 г хлористой ртути (сулемы).

Вероналовый буфер (pH — 8,6). В 1 л воды при нагревании растворяют 20,6 г мединала и 1,84 г веронала.

При электрофорезе казеина вероналовый буфер должен содержать 40% мочевины. В 1 л воды при нагревании раство­ ряют вначале 20,6 г мединала, а затем— 1,84 г веронала. После этого к 600 мл полученного раствора добавляют при нагревании 400 г мочевины. Такой раствор применяют для сма­ чивания хроматографических полосок бумаги, заполнения кю­ вет электрофоретической камеры и кювет с электродами.

Размер и средний вес частиц казеина. Измеряется световой поток при прохождении через обезжиренное молоко, разбав­ ленное 0,01 н. раствором СаСЬ. По световому потоку опреде­ ляют коэффициент светорассеяния, по которому рассчитывают вес частиц казеина, а по весу — и их размер.

С помощью пипетки 5 мл обезжиренного молока вливают в мерную колбу на 250 мл, которая предварительно на 2/3 за­ полнена 0,01 н. раствором хлористого кальция. После разме­ шивания содержимого колбы объем ее доводят до метки рас­ твором хлористого кальция и вновь перемешивают. Сразу же одну кювету колориметра заполняют раствором из колбы, а другую — 0,01 н. раствором хлористого кальция и начинают колориметрирование на ФЭК-М, используя зеленый свето­ фильтр. Еще до колориметрирования нулевое положение при­ бора должно быть установлено путем постановки двух кювет с 0,01 н. раствором хлористого кальция.

88

Для устранения ошибок, связанных с наличием следов жи­ ра, проводят параллельный опыт, исследуя образец обрата, разбавленного 0,05 н. раствором соляной кислоты в том же соотношении, что и при использовании раствора хлористого кальция. Полученную величину оптической плотности с соля­ ной кислотой вычитают из показателя оптической плотности, определенной с раствором хлористого кальция.

Рассчитывают коэффициент светорассеяния экстинкции по следующей формуле:

D

I

где Т — коэффициент светорассеяния;

D — оптическая плотность смеси молока с 0,01 н. раство­

т

По показателю Г определяют В = ^ — величину, выражаю­

щую вес частиц казеина без поправки на возможную коагуля­ цию частиц в период определения. В формуле Я — величина-,

89