книги из ГПНТБ / Методики постановки опытов и исследований по молочному хозяйству [сборник]

рия (Na2S04). Растворенные жирные кислоты в хлороформе сливают в стаканчик.

Такое извлечение кислот проводится 2—3 раза, при этом необходимо учитывать, чтобы объем жидкости в стаканчике не превышал 5—7 мл.

Раствор кислот, полученный описанным путем, переносят на свежую колонку из силикагеля. Когда раствор кислот в колонке почти «войдет» в столбик силикагеля, в колонку вно­ сят 10—15 мл хлороформа. По мере вытекания раствора эту операцию повторяют. Элюаты должны быть собраны в цилинд­ ры по 5 мл. Содержимое цилиндров титруют из микробюретки 0,01—0,02 н. спиртовым раствором NaOH с фенолфталеином.

Каждая жирная кислота выделяется в нескольких элюатах (3—6). Между отдельными элюатами с кислотами имеются элюаты и без кислот. Эти элюаты и показывают границы раз­ деления отдельных жирных кислот. Сначала из колонки вы­ тесняется каприловая, а затем капроновая кислота.

По 'Окончании выделения капроновой кислоты в колонку наливают 20%-ный раствор нормального бутилового спирта в хлороформе для вытеснения масляной кислоты. После выде­ ления этой кислоты и 3-кратного промывания хлороформом колонка может использоваться для следующего анализа.

Содержание летучих кислот в молочном жире выражают в весовых процентах. Для этого вычисляют количество отдель­ ных кислот — масляной, капроновой и каприловой — в 100 г всей суммы жирных кислот, условно принимая их содержание в молочном жире 93%.

Пр и ме р . По данным проведенного анализа, в 100 мл рас­ твора кислот, отогнанных из 1 г жира, содержалось каприло­ вой кислоты 11,19; капроновой — 8,52 и масляной— 17,58, выраженных в мг NaOH. /Количество кислот (в мг) устанав­ ливается по формуле

К-

60

Конъюгированные жирные кислоты

Полиненасыщенные жирные кислоты молочного жира спо­ собны поглощать световую энергию в ультрафиолетовой обла­ сти спектра. Причем жирные кислоты с изолированными (иеконъюгпрованными) связями — линолевая, линоленовая и арахидоновая — поглощают свет в области спектра ниже 200 ммк, а их соответствующие изомеры с конъюгированными связями имеют полосы поглощения в участках спектра с боль­ шей длиной волны. Максимум поглощения в области 228'— 233 ммк соответствует непредельным кислотам с двумя двой­ ными связями (диеновым), в области 268—270 ммк — с тремя двойными связями (триеновым) и в области 298—322 ммк — кислотам с четырьмя двойными связями (тетраеновым). Эти полосы поглощения могут быть использованы для количест­ венного анализа смеси конъюгированных жирных кислот.

При определении конъюгированных кислот поступают сле­ дующим образом. В мерную колбочку на 50 мл отвешивают 0,16—0,18 г профильтрованного молочного жира и добавляют до метки n-гексан. Этот раствор жира является исходным для определения диеновых и триеновых кислот.

При определении диеновых кислот исходный раствор жира разбавляют гексаном в соотношении 1 :4—1 : 8 (чем выше со­

югированных тетраеновых кислот. Перед анализом содержи­ мое колбочек тщательно перемешивается.

61

Определение ведется на спектрофотометре СФД-2. Оптиче­ ская плотность растворов жира определяется для диеновых кислот при длине волны 233 ммк, для триеновых — при 262, 268 и 274 ммк, для тетраеновых — при 308, 316 и 322 ммк.

Удельный коэффициент погашения К вычисляют для каж­ дой длины волны по общему уравнению

водится. Оптическая плотность растворов жира составила

ция растворов жира в гексане составляет для диеновых кис­

лученные значения в формулы, находят процентное содержа­ ние кислот в жире.

62

0,0073+0,0055_ =Q[Q020; К;(!4 =2,6x0,0020=0,0050.

Са =0,84 X 0,5938 =0,4988 %,

С„,з =0,47 X0,0258=0,0121 %,

С„-л =0,45 ХО,0050=0,00225 %.

П р и б о р ы и р е а к т и в ы : спектрофотометр, аналитиче­ ские весы, мерные колбы на 25 и 50 мл с притертыми пробка­ ми, колбы Эрмленмеера на 100 мл с притертыми пробками, п-гексан.

Неконъюгированные жирные кислоты

Неконъюгированные кислоты способны поглощать свето­ вую энергию в области спектра ниже 200 ммк. Но эта область спектра (вакуумного ультрафиолета) недоступна в настоя­ щее время для широкого круга исследователей. Поэтому при количественном определении неконъюгированных кислот их лереводят в кислоты с сопряженными связями (определяемые при световой волне более 200 ммк путем изомеризации.

Изомеризацию проводят в течение 25 мин. при температу­ ре 180± 1° и концентрации КОН в этиленгликоле 6,5—6,6%. В колбу из жаростойкого стекла емкостью 250 мл и высотой 100 мм отмеривают 70 мл этиленгликоля и помещают ее в баню при 100°. Затем температуру бани повышают до 120°, колбу вынимают и осторожно вносят навеску КОН — 6,6 г, вновь помещают в баню, температуру которой поднимают до 190°, и выдерживают 10 мин. ЙВдальнейшем колбу вынимают, охлаждают холодной водой и проверяют концентрацию КОН.

63

Если концентрация КОН выше 6 ,6 %, то по расчету добав­

11г приготовленного раствора КОН, закрывают и помещают

в'баню .при 180°, выдерживая 20 мин. Затем в них опускают сосудики с навесками жира. Две колбы (из 6 ) остаются для контроля — в них опускаются пустые сосудики. Содержимое колб энергично встряхивают и помещают колбы в баню при 180°. Через 25 мин. штатив с колбочками вынимают и поме­ щают в холодную воду.

После охлаждения колбы вынимают из штатива, откры­ вают, удаляют конденсационную влагу, содержимое колб ко­ личественно переносят в колбочки емкостью 50 мл с притер­ тыми пробками (3—4 раза споласкивая метиловым спиртом) и доводят до метки. Колбы ставят в холодильник на ночь для осаждения веществ, выделяемых из стекла горячим щелочным раствором. На следующий день содержимое колб доводят до комнатной температуры и фильтруют через бумажные филь­ тры. Из исходного раствора приготавливают растворы нуж­ ной концентрации путем разведения метиловым спиртом (для диеновых кислот разведение примерно 1 : 2 0 , для триеновых— 1 : 7, для тетраеновых— 1:1, или исходный раствор).

Затем производят замеры на спектрофотометре при тех же длинах волн, что и в случае конъюгированных кислот, по сравнению с холостой пробой.

Высчитывается удельный коэффициент погашения для каж­ дой длины волны, обозначаемой как КЛ Из удельных коэф­ фициентов погашения К'л.-г, К'л.-з и К'лы вычитают коэффи­ циенты К л:2 ) К л : 3 И К л : 4 ПерВОНаЧЭЛЬНО ПРИСУТСТВУЮЩИХ

конъюгированных кислот.

Разница между удельным коэффициентом погашения жира при соответствующей длине волны nocyie изомеризации и до нее будет представлять коэффициент погашения неконъюгированных составляющих.

Вычисление коэффициента погашения проводится по сле­ дующим уравнениям:

64

Содержание неконъюгированных кислот (в %) рассчиты­

ления диеновых кислот применяется разведение 1 : 2 0 , триеновых— 1 :7 и тетраеновых — 1 : 1. Оптическая плотность рас­ творов жира составила при длине волны 233 ммк — 0,462 (диеновые кислоты), при длине волны 262, 268 и 274 ммк —

Подставляя .полученные значения в формулы, получаем про.- центное содержание кислот в жире.

К' «:4 =2;06Х (0,0559—.°'0377+ 0»0260 ) —0,0050=0,0444.

С' п:2 = 1,086 X2,5012—1,342 X0,44.20+ 0,4 X0,0444 = 2,1409%,

С' л:з = 1,98X0,4420—4,92X0,0444=0,6567%,

С '„:4 = 4,69+ 0,0444 = 0,2082%.

VI. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ

С. А. ЛУЧКИНА

■При исследовании фосфолипидов применяют метод тонко­ слойной хроматографии, позволяющий быстро разделить смесь фосфолипидов на индивидуальные компоненты. 'На ка­ федре частично модифицирован ряд методик, объединенных в единый процесс, позволяющий установить содержание фос­ фолипидов в молоке и молочных продуктах.

Главные операции следующие:

1 . Экстрагирование фосфолипидов и очистка их (в основе метод J. Folch et al., 1957).

'2 . Разделение смеси фосфолипидов на тонком слое сили­ кагеля и идентификация их (в основе метод Э. В. Дятловской

идр., 1959).

3.Количественное определение фосфолипидов по фосфору (в основе метод De Bohner L. S. et al.,.1965).

Экстрагирование. Применяют смесь хлороформ—метанол

(2 : 1), разрушающую липопротеиновые комплексы и экстра­ гирующую одновременно с фосфолипидами нейтральный жир и свободные жирные кислоты.

Натуральное или сгущенное молоко предварительно обез­ воживается ацетоном (сухое цельное молоко используется не­ посредственно), так как вода затрудняет извлечение липидов. С этой целью продукт (20 г) измельчают в 5-кратном объеме ацетона в течение 5 мин. при 4000 об/мин. на микроразмельчителе тканей. .Гомогенат фильтруют через стеклянный фильтр № 4 в перегонную колбочку. Сухой остаток с фильтра-

куда предварительно удаляют смесь ацетон —вода в вакуум-

67

ном испарителе при температуре 30°, поскольку ацетон ча­

стично экстрагирует липиды.

Очистка. Липидные экстракты, выделенные смесыо хлоро­ форм-метанол, содержат нелипидные примеси — мочевину, лактозу, аминокислоты, мешающие дальнейшему анализу. Для удаления их экстракт переносят в делительную воронку и взбалтывают с 20 мл 0,37%-ного КС1, после чего оставляют на 2,5 часа. Верхний спирто-водо-солевой слой, не содержащий липиды, удаляют. Нижний хлороформенный слой, содержащий чистые липиды, сливают в перегонную колбочку. Раствори­ тель отгоняют под вакуумом при 40° до постоянного веса. Очи­ щенный экстракт представляет собой смесь фосфолипидов, ней­ трального жира, свободных жирных кислот, жирорастворимых витаминов и используется для определения общего содержа­ ния фосфолипидов и фракционирования смеси. Используемый метод позволяет извлечь до 98% общих липидов молока.

Разделение. Для отделения от других фракций и разделе­ ния фосфолипидов применяют двухмерную тонкослойную хро­ матографию. Метод основан на том, что отдельные фосфоли­ пиды, в соответствии с полярными свойствами их молекул, постепенно поглощаются адсорбентом из движущегося раство­ рителя. Нейтральный жир и свободные жирные кислоты вы­ носятся с фронтом растворителя, а жирорастворимые витами­ ны остаются на старте.

В качестве адсорбента используют силикагель, размер ча­ стиц 70—100 мк. Для получения зерен такой величины сили­ кагель марки КСК, предварительно размолотый на шаровой мельнице, просеивают через сито с отверстиями около 10 0 мк. Для удаления самых мелких частиц порошка производится отмучивание его в 1 0 -кратном объеме дистиллированной воды

втечение 3,5 час. Затем воду удаляют, а осадок высушивают при 105° в течение суток, вновь просеивают и смешивают с 5% гипса.

Готовый порошок в количестве 12 г интенсивно взбалты­ вают с 32 мл воды в закрытой колбочке. Полученную массу равномерно наносят на обезжиренную стеклянную пластинку (18x20 см). Для выпаривания воды ее помещают строго гори­ зонтально. Толщина адсорбционного слоя 400—500 мк. Перед нанесением экстракта хроматографические пластинки выдер­ живают в сушильном шкафу в течение 1 час. при 105°, затем охлаждают на воздухе.

Хлороформенный раствор липидов наносят'микропипеткой

водну точку на пластинке (рис. 7, пятно 7) в количестве, со-

68

ответствующем содержанию 8 — 10 мкг липондного фосфора. Затем пластинки помещают вертикально в круглую хромато­ графическую камеру (высота 25 см, диаметр 25 см) с крыш­ кой, куда предварительно налито 350 мл I системы раствори-; телей, состоящей из хлороформа, метанола и воды в соотно­ шении 65:25: 4. Глубина погружения пластинки не более 1 см, время разделения в направлении I около 90—100 мин. Затем пластинки просушивают на воздухе в течение 30 мин. и поме­ щают в такую же хроматографическую камеру, куда предва­ рительно налито 350 мл II системы растворителей, состоящей из хлороформа, метанола и аммиака в соотношении 14:6:1. Процесс разделения в направлении II занимает 30—40 мин.

Растворители перед непосредственным употреблением обез­ воживают и очищают по методикам, описанным в книге Ю. К.

Юрьева (1964).

Идентификация фосфолипидов. Расположение пятен инди­ видуальных фосфолипидов на хроматографической пластике устанавливается с помощью цветных реакций на характерные! функциональные группы молекул.

Фосфолипиды, содержащие свободные аминогруппы (фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), окрашиваются в красный цвет при опрыскивании пла­ стинок 0 ,2 %-ным нингидрином в смеси n-бутана и уксусной кислоты (95:5) и нагревании при 120° в течение 10 мин. Хо­ линсодержащие фосфолипиды (фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, сфингофосфатид) окрашиваются в желто-оранже­ вый цвет при опрыскивании реактивом Драгендорфа (смеши­ ваются раствор 850 мг основного азотнокислого висмута в 40 мл воды и 70 мл уксусной кислоты и 8 г йодистого калия в 2 0 мл воды; перед употреблением 1 мл исходного раствора разбавляют 2 0 мл уксусной кислоты и 10 мл воды).

Фосфатидилинозит дает бурое окрашивание при опрыски­ вании раствором азотнокислого серебра в уксусной кислоте.

На рис. 7 показаны хроматограммы фосфолипидов, экстра­ гированных из молока. Разделение в направлении I (рис. 7 а) в системе хлороформ— метанол—вода позволяет отделить ней­

4)лизофосфатидилхолин-f лизофосфатидилэтаноламин. Разделение в направлении II (рис. 7 б) в системе хлоро-

69