книги из ГПНТБ / Методики постановки опытов и исследований по молочному хозяйству [сборник]

Определение микробиологическими методами

Л. А. КРУГЛОВА

Для развития большинства микроорганизмов требуются витамины. С увеличением в среде концентрации того или иного витамина в определенных пределах пропорционально увели­ чиваются темпы роста и размножения микроорганизмов. Зная, какой концентрации исследуемого витамина соответствует та или иная степень роста культуры, можно по количеству кле­ ток в среде определить в ней количество витамина. Для опре­ деления витаминов подбирают индикаторные культуры, хо­ рошо развивающиеся на простых средах, с возможно меньшим набором витаминов. При помощи микробиологических методов можно определять витамины в таких концентрациях, которые трудно установить путем химических исследований.

Цианкобаламин (витамин Bi2)

Определение ведется при помощи индикаторной культуры Escherichia coli 113/3. Среды и растворы, необходимые для анализа: 1— среда для выращивания Е. coli — пептонно-соле- вой агар (2% пептона, 0,5% поваренной соли, 2 % агар-агара, pH 6 ,8 —7); 2 — среда для определения витамина Bi2. В 1 л среды должно содержаться: калия фосфорнокислого двузамещенного (К2НРО4) — 7 г, калия фосфорнокислого однозамещенного (КН2РО4) — 3 г, натрия лимоннокислого (СбН50 7Ыа3-

ные части последовательно растворяют в дистиллированной воде. Цианистый калий добавляют в виде раствора, в 1 мл ко­ торого его содержится 0,05—0,1 мг. Общая pH среды — 6 ,8 —7.

140

Составлен? j стандартной кривой. Стандартная кривая вы­ ражает степень роста индикаторной культуры при различных, но заведомо известных концентрациях в среде исследуемого витамина. Для получения стандартной кривой используют вод­ ный раствор витамина Bi2 с концентрацией 0 ,0 1 у/мл (основ­ ной раствор). Он хранится в холодильнике под слоем толуола. Перед опытом из основного раствора готовят рабочий раствор витамина концентрации 0,0001 у/мл. Для этого основной рас­ твор разводят в 1 00 раз 1 %-ным лимоннокислым натром.

Индикаторную культуру за сутки до анализа пересевают на косой агар указанного выше состава и выдерживают для выращивания культуры в термостате при 37°. Перед опытом из выросшей культуры готовят разведенную суспензию. Пет­ лей бактериальную массу (с булавочную головку) вносят в

50мл физиологического раствора.

Впробирки, помещенные в штативе (2 ряда по 9 шт. в каж­

дом), разливают по 5 мл опытной среды, добавляют рабочий раствор витамина В]2 в возрастающем количестве от 0,5 мл в первой паре пробирок до 4 мл в последней. Одна пара про­ бирок служит контролем, в них раствор витамина не вносят. Во всех пробирках количество раствора доводят дистиллиро­ ванной водой до 10 мл. Содержимое пробирок стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин. После охлаждения до комнатной темпера­ туры в каждую пробирку вносят по 1— 2 капли суспензии инди­ каторной культуры. Штативы с пробирками встряхивают и помещают в термостат при температуре 37° на 24 часа. Через сутки на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром определяют рост культуры по степени помутнения содержимо­ го пробирок. По полученным данным вычерчивают стандарт­ ную кривую.

Молоко. В пробирку отмеривают 10 мл молока, 1 н. раство­ ром НС1 устанавливают pH 5 (10 капель НС1). К пробе добав­ ляют 0,25 мл 10%-ного раствора нитрита натрия (NaN02) и перемешивают. Затем пробу автоклавируют при одной ат­ мосфере 10 мин. Содержимое пробирки переносят в мерную колбу на 50 мл, пробирку ополаскивают несколькими порция­ ми воды, сливаемой в колбу, объем которой доводят до метки. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр до получения прозрачного фильтрата. Фильтрат разводят 1%-ным лимоннокислым натром (5 мл фильтрата в мерной колбе до­ водят до 50 мл). Общее разведение составит 50 раз. Фильтрат молока разливают по пробиркам и проводят такие же опера­ ции, как со стандартным раствором витамина (см. раздел

141

«Составление стандартной кривой»). По показаниям фото­ электроколориметра на стандартной кривой для каждой пары пробирок находят содержание витамина В)2 в 1 мл фильтрата. Из полученных данных всех пробирок выводят среднюю вели­ чину (А). Умножая эту величину на степень разведения мо­ лока (50), определяют содержание витамина в 1 мл молока.

В]2у/л=А ■50 • 1000.

Молочные продукты. В кисломолочных продуктах содер­ жание витамина Bi2 определяют так же, как и в молоке, с уче­ том кислотности среды. Навески сыра, сгущенного молока, тво­ рога и других продуктов (1— 2 г) тщательно растирают в ступке и небольшими порциями теплой воды переносят в мер­ ную колбу на 100 мл, (общий объем жидкости около 50 мл). В колбу вносят 1,25 мл 10%-ного раствора нитрита натрия или 0,4 мл 0,1%-ного раствора цианистого калия, реакцию смеси 1 н. НС1 доводят до pH 4,5. После выдержки в автоклаве в те­ чение 10 мин. при 1 атм объем жидкости доводят до метки и фильтруют до получения прозрачного фильтрата. Дальнейшее разведение 1 %-ным лимоннокислым натром производят в за­ висимости от предполагаемого содержания витамина. Общее разведение для творога, сыра и сгущенного молока в 1 0 0 — 200 раз, сухого молока — 500 раз.

Пр и ме р . Определить содержание витамина Bj2 в молоке. Показания фотоэлектроколо.риметра, выражающие интенсив­ ность роста индикаторной культуры в среде со стандартным

142

Чем меньше бактериальных клеток в среде, тем больше све­ та через нее проходит, показания прибора поэтому уменьшают­ ся от начальных пробирок к конечным. По показаниям фото­ электроколориметра, полученным при анализе стандартного раствора витамина, вычерчивают кривую. На оси абсцисс на­ носят содержание витамина В12 в стандартном растворе для каждой пары пробирок, на оси ординат — показания прибора (средние данные). Полученные точки пересечения линий соеди­ няют (рис. 25).

на В12

Содержание витамина В12 в молоке определяют по стан­ дартной кривой следующим образом. Среднее показание при­ бора для первой пары пробирок— 65, что по кривой соответ­ ствует содержанию витамина 0,0000425 у. Учитывая, что в пер­ вой паре пробирок содержится 0,5 мл фильтрата молока, количество витамина в 1 мл в два раза больше — 0,000085 у. Такие расчеты производят для всех пар пробирок и опреде­ ляют среднее содержание витамина В12 в 1 мл фильтрата (А). В обработку не включают данные, отклоняющиеся от средней

143

величины более чем на 20%. Для удобства целесообразно вы­ черчивать стандартную кривую на миллиметровке. Каждое де­ ление в этом случае должно соответствовать определенному количеству витамина. В данном примере цена одного деле­ ния— 0,0000025 у витамина В]2. Показанию 65 соответствует 17 делений миллиметровки, 39—38 делений и т. д. Расчеты для всех пар пробирок проведены в табл. 26.

где 50—степень разведения молока. Содержание витамина в 1 л 435 у. Среднее содержание витамина Вi2, определяемое по описанной методике, в сборном молоке составляет 3,7—4,0, в твороге — 8 —12, сгущенном молоке — 7—14 у/кг.

Пантотеновая кислота (витамин В3)

Определение этого витамина ведется при помощи культуры

Saccharomycodes Ludwigii КМ, которая растет на сахаро-ми­ неральной среде и требует сравнительно небольшого набора витаминов.

Среды и растворы, необходимые для определения пантотеновой кислоты: 1 — основная среда, на которой поддерживает­

форнокислый двузамещенный КгНР04 — 0,02. Компоненты в

144

порядке перечисления растворяют в дистиллированной воде раствором 0,1 н. ИС1, pH среды устанавливают в пределах 5— 5,5; 3 — растворы витаминов Вь пиридоксина и никотиновой

1 атм. в течение 60 мин. для разрушения в молоке пантотеновой кислоты, нейтрализуют насыщенным раствором Ва(ОН) 2 до pH 5—5,5 и фильтруют. Фильтрат разводят в 10 раз водой, разливают в 100 мл колбы и стерилизуют при 1 атм 20—30 мин. Колбы с подготовленным материалом хранят в течение дли­ тельного времени и используют по мере надобности; 5 — рабо­ чий раствор пантотеновой кислоты концентрации 0 , 0 2 у/ыл готовят перед анализом из основного раствора ( 2 у/мл).

Составление стандартной кривой. Индикаторную культуру дрожжей за двое суток до анализа пересевают на сусловый агар и выдерживают в термостате при 27°. Перед анализом из выросшей культуры готовят разведенную суспензию. Для это­ го петлей берут около 10 мг дрожжей и вносят в 1 0 0 мл физио­ логического раствора и тщательно размешивают до равномер­ ной слабой мути. Готовят опытную среду. Для этого к сахаро­ минеральной среде добавляют вытяжку из молока и витами­ ны: на 1 л среды 50 мл вытяжки, по 5 мл витамина Bi и нико­ тиновой кислоты, 0,5 мл пиридоксина и 2—3 капли биотина. Среду разливают в пробирки по 5 мл (в штативах 2 ряда по 9 пробирок). Затем добавляют рабочий раствор пантотеновой кислоты в возрастающем количестве: в первую пару проби­ рок— по 0,5; во вторую — 1 и т. д. до 4 мл. Одна пара проби­ рок служит контролем. В них пантотеновую кислоту не вно­ сят. Во всех пробирках общий объем водой доводится до 10 мл. Содержимое пробирок стерилизуют при 0,5 атмосферах в те­ чение 20 мин. и охлаждают до комнатной температуры. В каж­ дую пробирку вносят по 2 капли суспензии индикаторной куль­ туры. Штативы с пробирками помещают на 48 час. в термо­ стат при 27°. Для лучшей аэрации штативы с пробирками ста­ вят наклонно, под углом25°. Через 48 час. по степени помут­ нения среды определяют рост культуры во всех пробирках. Определение ведут на фотоэлектроколориметре с зеленым све­ тофильтром. По показаниям прибора, соответствующим кон­

количество 96° спирта. Смесь фильтруют и 1 мл. фильтрата разводят до 200 мл водой. Таким образом достигается 400-кратное разведение молока. Далее в 9 пар пробирок раз­ ливают по 5 мл опытной среды (при массовых исследованиях количество пробирок можно сократить до 6 пар). В пробирки вносят разведенный фильтрат молока в возрастающих коли-

Рис. 26. Кривая для определения пантотеновой кислоты

чествах от 0,5 мл в первой паре до 4 мл в последней (при 6 па­ рах пробирок не включают первую и последнюю пары). В даль­ нейшем проделывают операции так же, как указано в разделе «Составление стандартной кривой». По показаниям фото­ электроколориметра путем интерполяции на стандартную кри­ вую определяют содержание пантотеновой кислоты в 1 мл раз­ веденного фильтрата. Определение проводят для всех пар про­ бирок, а из полученных величин высчитывают среднюю (А). Содержание пантотеновой кислоты в 1 л молока находят по формуле А -400-1000, где 400 — степень разведения молока.

Молочные продукты. Определение пантотеновой кислоты в кисломолочных продуктах проводят так же, как в молоке. Сливки предварительно разводят в 5 раз теплой водой ( 1 0 мл

146

сливок+ 40 мл воды). В твороге, сыре, сгущенном и сухом мо­ локе содержание пантотеновой кислоты определяют следую­ щим образом: к 1— 2 г тщательно растертого продукта добав­ ляют 8—9 мл теплой (30—35°) воды, смесь растирают в ступ­ ке до гомогенного состояния, переносят в пробирку, ступку смывают 96° спиртом (10 мл) в пробирку, перемешивают со­ держимое и фильтруют до получения прозрачного фильтрата. Фильтрат разводят водой, устанавливают pH 5—5,5. Общая, степень разводки для кисломолочных продуктов и сливок 400, сыра — 100, сгущенного молока — 500, творога— 100, сухого молока — 1 0 0 0 раз.

Определение содержания пантотеновой кислоты в молоке; показано на примере. Показание фотоэлектроколориметра для стандартного раствора витамина и испытуемого молока

Содержание пантотеновой кислоты в молоке определяют по стандартной кривой (рис. 26) так же, как в предыдущей методике. Средние показания степени мутности для первой па. ры пробирок — 75, что по стандартной кривой соответствует 0,005 у. Учитывая, что в первой паре пробирок было по 0,5 мл испытуемого раствора, то в 1 мл его содержится 0,01 у. Так следует поступать со средними показателями для каждой пары пробирок. Из всех величин высчитывают среднюю (А). Для приведенного примера средняя из 8 показателей составила 0,0097 у. Поскольку фильтрат молока перед анализом был раз­

147

веден в 400 раз, то в 1 л молока содержание пантотеновой кис­ лоты будет равно 0,0097 • 400 • 1000= 3,88 мг/л.

В сборном молоке содержание пантотеновой кислоты, най­ денное по описанной методике, составляет в среднем 3,5 мг, в сыре— 1,5—4, сгущенном молоке — 8 —9, сухом — 25—30, твороге— 1,4—3 мг/кг.

Биотин (витамин Н)

Определение биотина ведется при помощи test-культуры Endomyces magrusii. Среды и растворы, необходимые для определения биотина: 1 — основная среда, на которой поддер­ живается культура — сусловый агар; 2 — сахаро-минеральная среда Ридер. Состав среды описан в методике для паитогеновой кислоты. В методике для биотина половину сернокислого аммония заменяют гликоколом; 3 — раствор витамина Bi — 1 мг/мл. Его стерилизуют в кипящей водяной бане в течение

20мин.; 4 — раствор биотина — 0,00025 у/мл.

Составление стандартной кривой. Индикаторную культуру

дрожжей за двое суток до анализа переселяют на сусловый агар и выдерживают в термостате при 27°. Перед анализом из выросшей культуры готовят суспензию: берут около 10 мг дрожжей, вносят их в 10 0 мл физиологического раствора и тщательно размешивают.

В среду Ридер вносят 10 мл раствора витамина Вь Все остальные приемы аналогичны операциям, описанным в ме­ тоде для'-определения пантотеновой кислоты. Естественно, что вместо раствора пантотеновой кислоты в пробирки разливают раствор биотина.

Молоко. В пробах молока серной кислотой доводят pH до 4,5—5 по универсальному индикатору (в мерные колбы на 50 мл вндсят 10 мл молока и 40 мл 0,2 н. H2S 04). Пробы авто^ клавируют при 1 атм. 10 мин., объем доводят до метки и фильт­ руют до прозрачности фильтрата. Один миллилитр фильтрата разводят в 50 раз водой. Общее разведение, таким образом, составит 250 раз. Все последующие операции те же, что и при определении пантотеновой кислоты.

Определение биотина может быть проведено с помощью культуры Saccharomycodes Ludwigii К. М. В этом случае ис­ пользуют те же среды и растворы, что и при определении пан­ тотеновой кислоты, только вместо биотина в опытную среду, наряду с другими витаминами, 'вносят пантотеновую кислоту в. концентрации 1 мг/мл, а биотин используют для стандарт-

148

ного раствора. Все остальные приемы общие для обеих ме­ тодик.

Молочные продукты. В молочных продуктах часть биотина находится в связанном состоянии, поэтому образцы подвер­ гают кислотному гидролизу. Навеску в 1 г (сыр, творог, сухое и сгущенное молоко и др.) тщательно суспензируют в 50 мл 2 н. HoSO.! и автоклавируют в течение часа при 1 атм. После этого содержимое колб через воронку переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки и фильтруют; 20—25 мл фильтрата нейтрализуют 2 н. КОН до pH 5—5,5 и разводят водой до конечной концентрации: сухое молоко — в 1 0 0 0 , сгу­ щенное— 500, сыр и творог — в 250 раз.

По полученным показаниям вычерчивают стандартную кривую, (рис. 27), по которой определяют содержание биотина в молоке так же, как в методиках при определении витами­ на В;2 и пантотеновой кислоты. Для первой пары пробирок по­ казание прибора 80, что по кривой соответствует содержанию биотина 0,075 ту, или 0,00015 у в 1 мл разведенного фильт­ рата, и так для всех пар пробирок. Среднее из 8 пар пробирок для приведенного примера составит 0,000151 у. Учитывая сте­ пень разведения молока 250 раз, содержание биотина в 1 л со­ ставит 0,000151 -250-1000 = 37,8 у/л. Среднее содержание био-

149