книги из ГПНТБ / Методики постановки опытов и исследований по молочному хозяйству [сборник]

ственно в соотношении I : 2 и вновь проводят отсчеты после га­ шения.

Количество рибофлавина (Кi) рассчитывают по формуле

М—В) ■ е • в • ж

Кх = , r " r n------- ■

1 (С—Ci) • а -л

где А — показание прибора для исследуемого раствора (38); В — показание прибора для исследуемого раствора после га­ шения (10); С — показание прибора для стандартного раство­ ра (30); Ci — показание прибора для стандартного рас­ твора после гашения (6); е — содержание рибофлавина в 1 мл

ж— конечный объем раствора, взятого для определения флу­

100 мл отвешивают 80 г продукта. Проводят кислотный и фер­ ментативный гидролизы с последующим определением вита­ минов В[ и Вг по методике, описанной для молока. Обращает­ ся внимание на необходимость строго придерживаться pH сре­ ды, указанной в методике.

Сметана. Среднюю пробу сметаны 30 г разбавляют водой (45—50°), переносят в колбу на 100 мл. Дальнейшая работа проводится согласно методике для молока.

Масло. Среднюю пробу масла 30 г помещают в фарфоро­ вую чашечку, заливают небольшим количеством воды (45— 50°) и переносят в мерную колбу на 100 мл. Дальнейшая рабо­

Дальнейшее определение осуществляется по методике, описан­ ной для молока.

П ри боры и р е а к т и в ы : флуорометр ЭФ—ЗМ, зстряхиватель, термостат, делительные воронки на 15—20 мл, мер­ ные колбы на 100 мл с обратным холодильником, мерные ци­ линдры на 50 и 100 мл, пробирки из нефлуоресцирующего стек-

130

ла на 2.5 мл, пипетки иа 1,5, 10 и 25 мл серная кислота (плот­ ность 1,84), уксуснокислый натрий 2,5 М, хлористый калий 25% в 0,1 n НС1, красная кровяная соль 1%с, едкий натрий 15%, раствор тиаминхлорида, раствор рибофлавина, фермен­ тативный препарат «Оризин-ПК» или «Авамарин-ППК», толу­ ол, изобутиловый спирт, уксусная кислота 3%, адсорбент декальсо или СДВ-3, этиловый спирт 96%, универсальная инди­ каторная бумага (pH 1—10).

Приготовление некоторых реактивов. 1. Основной раствор тиаминхлорида: а) раствор № 1 — 0,1 мл НС1 (плотность 1,19) доводят водой до 100 мл; б) раствор № 2 — 25 мл этилового спирта доводят до 100 мл раствором № 1; в) 10 мг тиаминхло­ рида доводят до 100 мл раствором № 2. Раствор устойчив в течение 1,5 мес. при хранении в темной склянке (t 2—4°).

2. Рабочий раствор тиаминхлорида (готовится перед опре­ делением), 1 мл основного раствора доводят водой до 100 мл. 1 мл рабочего раствора содержит 1 мкг тиамина.

3.Основной раствор рибофлавина: 2 мг рибофлавина рас­ творяют в 50 мл воды. Раствор стоек в течение 1 мес. при хра­ нении в темной склянке (t 2—4°).

4.Рабочий раствор рибофлавина (готовят перед определе­ нием): 1 мл основного раствора доводят до 100 мл водой. 1 мл рабочего раствора содержит 0,4 мкг рибофлавина.

1 Ферментный препарат «Оризин-ПК», или «Авамарин» изготовляют на ферментных заводах. Хранить их необходимо в сухом месте.

131

5. В случае флуоресценции йзобутилового спирта его обра­ батывают активированным углем (15 г на 1 л), после чего пе­ регоняют (температура кипения 108°).

6. Окислительная смесь. Основной раствор красной кровя­ ной соли: 1 г красной кровяной соли растворяют и доводят до

15 мин-, затем 15 мин. кипятят в 25%-ном растворе КС1. Пос­ ле этого промывают кипящей водой до отрицательной реакции на хлор. Адсорбент СДВ-3 активируют в 6%-ной серной кис­ лоте (на 10 мг адсорбента 100 мл кислоты) в течение суток при помешивании. Затем промывают на слабом вакууме во­ дой до нейтральной реакции на хлор.

Фолиевая кислота (витамин Вс)

Метод основан на адсорбции фолиевой кислоты активи­ рованным углем, окислении десорбированного витамина мар­ ганцовокислым калием с последующим измерением флуорес­ ценции в области свечения 470 ммк. При окислении от фолие­ вой кислоты отщепляется парааминобензойная кислота, кото­ рая вместе с глютаминовой кислотой образует птеридил—6 карбоновую кислоту, обладающую интенсивной голубой флуо­ ресценцией. Определение фолиевой кислоты проводится на флуорометре ЭФ-ЗМ.

Молоко. В мерную колбу на 100 мл вносят 35 мл молока, 45 мл воды, доводят pH до 3,5—4, 10—12 каплями 15% H2S 04.

В этой же колбе с обратным холодильником проводят кислот­ ный гидролиз на кипящей бане в течение 45 минут.

Гидролизат охлаждают до 32—35°, доводят pH среды до 4,5—5, затем вносят 100 мг ферментативного препарата

«Оризин-ПК» или «Авамарин-ППК», растворенного в 10 мл воды. Прибавляют 3 капли толуола и оставляют на 16—18 ча­ сов в термостате при температуре 38—40° для ферментативно­ го гидролиза.

По истечении указанного времени содержимое колбы ох­ лаждают до 20°, доводят объем до 100 мл водой и фильтруют.

50 мл фильтрата подкисляют 15% H2S 04 до pH 3,0, вносят 100 мг активированного угля и кипятят 5 минут. Уголь от­ фильтровывают под вакуумом на воронке Бюхнера со слоем

132

картона Зейца. Адсорбированную на угле фолиевую кислоту вымывают в чистую колбу кипящей элюирующей смесью 3 порциями по 20 мл и доводят общий объем до 70 мл.

Элюат переносят в колбу для отгонки, соединенную с пря­ моточным холодильником, отгоняют до объема 10—15 мл. Упа­ ренный фильтрат охлаждают до 20°, подкисляют 10% НгЭС^до pH 3. Марганцовокислым калием проводят окисление фолие­ вой кислоты в птеридил-6-карбоновую кислоту. Для этого в фильтрат по каплям вносят 4% KMn04 при помешивании до появления устойчивой розовой окраски, не исчезающей в тече­ ние 10 минут.

Избыток марганцовокислого калия удаляется добавлением по каплям 3% перекиси водорода (Н20 2) до обесцвечивания, подщелачивают 15% NaOH до pH 4—4,5, фильтруют и доводят объем до 25 мл водой. Затем 10 мл фильтрата переносят в про­ бирку из нефлуоресцирующего стекла и делают замер на при­ боре (светофильтр 470 ммк). Параллельно ставят холостую

обработку, как с молоком.

Для определения флуоресценции стандартного раствора в колбу на 50 мл вносят 10 мл рабочего раствора фолиевой кис­ лоты, доводят pH до Зн. 15% H2S 04, обрабатывают аналогично молоку. Конечный объем фильтрата доводят до 20 мл водой.

Содержание фолиевой кислоты (К) в мкг/кг рассчитывают по формуле

(В—С) •е - у- л

А - Д - Ж

где А — показание прибора для стандартного раствора (20); В — показание прибора для ис­

следуемого раствора (14); С — показание прибора для холо­

или 428,6 мкг в 1 кг молока.

Содержание фолиевой кислоты в молоке колеблется от 140 до 600 мкг/кг.

133

Простокваша, кефир, ацидофилин. Среднюю пробу продук­ та в количестве 35 г вносят в мерную колбу на 100 мл. Кислот­ ный и ферментативный гидролизы с последующим определени­ ем фолиевой кислоты проводят по методике, описанной для молока. Обращается внимание на необходимость строго при­ держиваться pH среды, указанной в методике.

Сметана. Пробу в количестве 10 г переносят в колбу на 100 мл, добавляют 70 мл воды. Дальнейший анализ проводят согласно методике, описанной для молока.

Масло. Пробу масла в количестве 10 г переносят в колбу на 100 мл, добавляют 70 мл воды. Дальнейший анализ по мето­ дике, описанной для молока.

Сыр. Пробу 5 г сыра, тщательно измельченного, переносят в колбу на 100 мл. Дальнейшее определение осуществляется по методике, описанной для молока.

П р и б о р ы и р е а к т и в ы : флуорометр ЭФ-ЗМ; термо­ стат; водоструйный насос; колбы мерные на 100 мл с обратным холодильником; колбы Бунзена; пробирки из нефлуоресциру­ ющего стекла на 25 мл; пипетки мерные на 0,5, 1,10 и 50 мл; прибор для перегонки; фолиевая кислота; серная кислота 15%; едкий натрий 15%; марганцовокислый калий 4%; перекись во­ дорода 3%; 10% водный раствор перегнанного анилина; элю­ ирующая смесь; активированный уголь; ферментный препарат «Оризин-ПК» или «Авамарин-ППК»; толуол; универсальный индикатор (pH 1—10).

Приготовление некоторых реактивов:

1. Элюирующая смесь: 1000 мл 96-%-ного этилового спирта, 420 мл воды и 200 мл 25% ЫН4ОН.

2.Активированный уголь: обычный активированный уголь заливают 10-кратным количеством 10%-ного водного раствора анилина, кипятят в течение часа, затем отфильтро­ вывают. Уголь промывают 5—б раз водой, высушивают при 30—40° и сохраняют в склянке с притертой пробкой.

3.Стандартный раствор фолиевой кислоты: готовят из пе-

рекристаллизованной фолиевой кислоты. Для этого 20 мг фо­ лиевой кислоты растворяют в 100 мл воды, подщелоченной 2 каплями 15% NaOH. Раствор хранят в-темной склянке на холоду под слоем толуола.

4.Рабочий раствор готовят перед анализом. 1 мл стандарт­ ного раствора доводят до 100 мл водой. В 1 мл этого раство­ ра содержится 1 мкг фолиевой кислоты.

5.Ферментные препараты — «Оризин-ПК» или «Авама- рин-ППК» — выпускаются ферментными заводами.

134

Холин

Метод основан на извлечении холина и содержащих холин фосфатов метиловым спиртом. Гидролиз фосфатов проводится

внасыщенном растворе гидроокиси бария. Холин определяют

врастворе рейникат-холина, образующегося при взаимодей­ ствии холина с солью Рейнике на фотоэлектроколориметре марки ФЭК-М.

Молоко. 10 мл молока по каплям наносят на рулончик, ска­ танный из фильтровальной бумаги и установленный в чашку Петри, высушивают в термостате при 80—90° 4—5 час., охлаж­

135

Стандартная калибровочная кривая готовится следующим образом: из основного раствора, содержащего 1 0 0 мг холинхлорида в 1 0 0 мл воды, готовят водный, слегка щелочной рас­ твор (pH 8 ), в каждых 10 мл которого соответственно содер­ жится 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8 , 9, 10 мг холинхлорида. Для приготовления раствора берут 10 мерных колб на 10 мл и вно­ сят в них стандартный раствор холинхлорида, как указано ниже, а затем водой доводят до метки:

Полученные различных концентраций растворы переносят на рулончики фильтровальной бумаги, которые ставят в чашки Петри, высушивают в термостате при 80—90°. В последующем проводят те же манипуляции, что и с опытными образцами. В заключение составляют стандартную калибровочную кривую.

Пр и ме р . Экстинкция молока — 0,09, по калибровочной кривой она соответствует 3,6. Следовательно, в 10 мл молока содержится 3,6 мг холина, а в 1 л — соответственно 360 мг.

Содержание холина в молоке колеблется от 200 до 800 мг/кг.

Простокваша, кефир, ацидофилин. 10 мл продукта пипеткой наносят на рулончик фильтровальной бумаги, высушивают в термостате при 80—90°, далее определение ведут так же, как в молоке.

Сыр, творог. В пакетик из фильтровальной бумаги взвеши­ вают 5 мг измельченного продукта и высушивают в термостате при 80—90°. В дальнейшем определение ведется так же, как и в молоке.

П р и б о р ы и р е а к т и в ы : рулончики из фильтроваль­ ной бумаги— ширина 6 —7 см, длина около метра, фотоэлек­ троколориметр ФЭК-М, водоструйный насос, аппарат Гейда, стеклянный фильтр № 3 или 4 со шлифом, цилиндр на 50 мл со шлифом, насадка для соединения стеклянного фильтра с цилиндром, чашки Петри, пробирки мерные на 10—15 мл с притертыми пробками, песочная баня, метиловый спирт абсо-

136

лютный, 2%-ный раствор соли Рейнике на метаноле, гидро­ окись бария насыщенный раствор, уксусная кислота концен­ трированная, раствор тимолфталеина 1 %-ный, ацетон.

Никотиновая кислота (витамин РР)

В основе метода цветная реакция, разработанная Кёнигом, основанная на способности а- или (3-незамещекных дериватов пиридина давать окраску с бромцианом и ароматическим ами­ ном. В качестве ароматического амина используется анилин.

Определение никотиновой кислоты проводится на штуфен-

носят пипеткой в мерную колбу на 50 мл с обратным холодиль­ ником. К молоку добавляют 10 мл НС1 (удельный вес 1,19) и гидролизуют 45 мин. в кипящей бане. Охлажденный раствор доводят до метки водой и фильтруют. 15 мл фильтрата пере­ носят в пробирку из стекла пирекс. с 1,8 н. раствором едкого натрия (1,5—1,8 мл) и доводят pH до 0,5—1. Реакцию среды устанавливают при помощи индикатора метилвиолета (1 капля индикатора с 0,2 н. I-bS04 дает синее окрашивание). Такое же окрашивание должно получиться при смешении метилвиолета с каплей исследуемого раствора. В случае избытка щелочи до­ бавляют концентрированную соляную кислоту.

Никотиновую кислоту адсорбируют на адсорбент аска­ нит, который вносят в раствор в количестве 2 г. Смесь встря­ хивают в течение 1 мин. и центрифугируют 2 мин., жидкость декантируют. Асканит промывают 10 мл 0,2 н. H2SO4 путем встряхивания, центрифугируют, использованную кислоту сли­ вают.

Никотиновую кислоту, адсорбированную на асканите, из­ влекают смесью 10 мл 0,5 н. NaOH и 5 мл воды, встряхивают, а затем центрифугируют. Для осаждения белков и красящих веществ к центрифугату добавляют 0,5 г кристаллического азотнокислого свинца, встряхивают и снова центрифугируют.

Практически бесцветную жидкость переливают в цробйрку. Для удаления избытка кислоты раствор слегка подщелачи­ вают фосфатом калия ( К 3 Р О 4 ) , который прибавляют по кап­ лям до появления слабо-розового окрашивания в присутствии капли фенолфталеина. Затем в растворе устанавливают ней­ тральную среду при помощи 80%-ной ортофосфорной кислоты и трифосфата калия (проба на лакмусовую бумажку), центри-

137

фугируют и отстоявшуюся жидкость используют для опреде­ ления никотиновой кислоты. Для этого в пробирки (А, В, С) переносят по 3 мл прозрачного раствора. В пробирку А прибав­

10 мин.— 1 мл 4%-ного спиртового раствора анилина. В про­ бирку С добавляют 0,1 мл стандартного раствора никотиновой кислоты, 6 мл 4%-ного раствора бромистого циана и через 10 мин. — 2 мл 4%-ного спиртового раствора анилина.

Появляющаяся в пробирках В и С желтая окраска стано­ вится интенсивной через 3 мин. после начала реакции. Интен­ сивность сохраняется в течение последующих 5 мин.

С целью проверки чистоты реактивов проводят холостое определение. Для этого в пробирку А вносят 3 мл дистилли­ рованной воды, в пробирки В и С — 3 мл воды, 6 мл 4%-ного раствора бромистого циана и 1 мл 4%-ного спиртового рас­ твора анилина.

Содержание никотиновой кислоты (в мкг) в 1 г молока вычисляют по формуле

( Д - Л ) - з - г - Ж

(С—В) -л-Д- 10 ’

где А, В, С — отсчеты на штуфенфотометре для соответствую­ щих растворов в пробирках А, В, С; л — навеска молока в г (10 г); з — объем элюированной никотиновой кислоты (15 мг); г — объем центрифугата после разбавления водой (50 мл); Д — количество раствора, взятого для определения на штуфен фотометре (3 мл); Ж — количество фильтрата, взятого для адсорбции (15 мл); 10 — количество никотиновой кислоты в

1мл стандартного раствора.

Врезультате проведенных отсчетов были получены следую­ щие данные— В= 0,05, А= 0,01, С= 0,62, Содержание вита­

мина составило

сыворотки отмеривают 10 мл фильтрата. Витамин определяет­ ся так же, как и в молоке.

Масло. 30 г масла заливают водой (45—50°). Смесь пере-

1138