книги из ГПНТБ / Замятнин, А. А. Дилатометрия растворов белков

V I I

О Б Ъ Е М Б Е Л К А В РАСТВОРЕ

ОБЪЕМ БЕЛКА, ЗАВИСЯЩИЙ ОТ ЕГО СОСТАВА

Р я д удачных примеров расчета кажущегося удельного объема белка методом Кона — Эдсалла может создать впечатление о при­ годности метода для решения широкого круга задач. Однако ме­ тод основан на предположении аддитивности, а это означает пре­ небрежение взаимовлиянием аминокислотных остатков, сопря­ женным с изменением их гидратации. Ясно, что такое допущение трудно согласовать с современными представлениями о силах, оп­ ределяющих конформацию макромолекулы с различным состо­ янием (гидратацией) аминокислотных остатков внутри и снаружи глобулы. Иными словами, в распространенном варианте метода не ставится наиболее интересная (для современных проблем) задача учета изменения объема при конформационных переходах макро­ молекулы .

Прежде чем рассмотреть величину объема белка, зависящую от вида конформации, попробуем найти объем, который остается не­ изменным при любых конформационных перестройках.

Д л я этого поставим задачу: определить такую условную вели­ чину объема белка, которая зависела бы только от его состава и не зависела от взаимодействия аминокислотных остатков между со­

величинами к а ж у щ и х с я удельных объемов аминокислотных остат­

81

,''Использовались только при расчете 0д яизоцима, РНКазы и частично яичного аль­ бумина.

82

роновой кислотам (норвалину и норлейцину) соответственно. По­ скольку присутствие норвалина и норлейцина в белках сомни­ тельно [233], нами произведена замена на значения, отвечающие а-аминоизовалериаиовой и а-аминоизокапроновой кислотам [14].

Все значения Фдо в табл. 7 получены из выражения (41). Д е ­ лением их па величину мольного веса аминокислотного остатка МАО получены к а ж у щ и е с я удельные объемы аминокислотных ос­ татков фі.

Таким, образом, для расчета составного объема мы будем поль ­ зоваться несколько модифицированным методом Кона — Эдсалла [6, 46—48] по формуле

і= 1

т. е. использовать величины фі, найденные только из экспери­

(47*), будут получены в предположении, что аминокислотные ос­ татки в белке взаимодействуют с молекулами растворителя так же ,

ствия с растворителем з а р я ж е н н ы х и неполярных групп боковых радикалов аминокислотных остатков и не будет учитывать взаимо­ действие аминокислотных остатков друг с другом в белке. Этот объем мы и называем составным.

Особый интерес представляют изменения объема, возникающие при связывании аминокислотных остатков в полипептидную цепь и при создании этой цепью некоторой конформации с возможными пустотами в пространственной структуре. Эти эффекты, естествен­ но, не учитываются при нашем расчете составных объемов белков по формуле (47*). Величину части объема белка, на которую от­ личается составный объем от экспериментально найденной вели­ чины объема, назовем коиформационным объемом и следующий подраздел посвятим нахождению этой величины.

ОЦЕНКА ВЕЛИЧИНЫ КОНФОРМАЦИОННОГО ОБЪЕМА

Величину конформационного объема белка можно оценить и з сравнения экспериментальных значений к а ж у щ и х с я удельных объемов белков ф% с величинами фо, полученными по модифи­ цированному нами методу Кона — Эдсалла. К а ж у щ и й с я удельный объем белка, определенный экспериментально, получен в услови -

83

я х осуществления взаимодействия аминокислотных остатков бел­

вых данных об аминокислотном составе ряда белков. Эти величины свидетельствуют об удовлетворительности общепринятого теоре­ тического метода определения кажущегося удельного объема бел­

Как уже было сказано, если при определениимолекулярного ве­ са белка из данныхпо седиментации и диффузии используется вели ­ чина кажущегося удельного объема, то ошибка в ее определении, равная 1% , приводит к ошибке в молекулярном весе уж е в 3% [149]. Следовательно, присутствие конформациоиного объема, по - видимому, вносит неопределенность порядка 3% в величину ис­ комого молекулярного веса, если для его вычисления используется кажущийся удельный объем белка, определенный методом Кона — Эдсалла.

Следует отметить, что метод оценки исключенного объема 0искл [149] согласно уравнению

нокислотных радикалов [15, 38, 42, 43, 149, 217, 219, 222].

84

Кажущиеся удельные объемы белков и величины конформационных объемов (в см3 /г) при 25°С [6, 46—48]

Эдсалла. Этот объем не затрагивается никакими конформационными перестройками и я в л я е т с я только суммой объемов элемен­ тов, составляющих молекулу белка. Н а рис. 39 показано, что с течением времени составный объем фс не изменяется.

Другим компонентом я в л я е т с я конформационный объем бел­

Поскольку, как нами показано, конформационный компонент объ­

Исследование кинетики таких переходов должно дать кривую, ле­

провождающими расщепление не только слабых, но и сильных свя ­ зей, таких к а к пептидные. П р и этом возможно отщепление малых пептидов от основной молекулы. В таком случае фо может и уменьшиться на некоторую величину, легко определяемую мо­

рактеристики в каждом конкретном случае могут варьировать самым различным образом. Можно представить, что при отщепле­ нии малого пептида от молекулы белка конформационный объем увеличится, к а к это показано на рис. 40.

Е с л и в настоящее время мы можем судить об изменениях объ­ ема при целом ряде конформационных переходов, то величины конформационного объема в каждой конформаций получить труд­

86

Р и с . 39. Гипотетическая схема, поясняющая определение величин составного и кон­ фирмационного объемов [46—48]

Р зі с . 40. Гипотетическая схема, поясняющая процесс изменения объема при разрыве сильных и слабых связей [46, 48]

тода. Обычно это измерение авторам необходимо производить для второстепенной цели, а именно, при сравнительно грубом опреде­ лении молекулярного веса в седиментационных методах. Кроме того, если с повышением чистоты препаратов белков и с развитием денситометрической техники все же делались попытки определить более точные значения этих величин [20, 149, 218], то новых дан ­ ных в литературе по парциальным и к а ж у щ и м с я объемам амино­ кислот нам найти не удалось. Все, кому необходимо вычислить фі, до настоящего времени пользуются величинами, приведенными Коном и Эдсаллом [217].

Увеличение точности при абсолютных и относительных изме­ рениях объема несомненно сможет дать достаточно новую и инте­ ресную информацию о конформационных превращениях в самых различных белковых системах.

ИЗМЕНЕНИЯ ОБЪЕМА БЕЛКА (СОПОСТАВЛЕНИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ

С ИЗВЕСТНЫМИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ ВЕЛИЧИНАМИ ОБЪЕМНЫХ ЭФФЕКТОВ)

Рассмотрение данных денситометрии в сочетании с дилатометри­ ческими помогает выяснить, какие эффекты следует ожидать при сборке молекулы белка из аминокислотных остатков, п р и протео- л и з е белков и, наконец, при конформационных переходах, не со­ провождающихся разрывом сильных связей. Эти данные были у ж е

87

нами подробно разобраны в разделах I V и V , и мы приведем их только в качестве иллюстраций к описанию полного объема белка.

Сборка молекулы белка из аминокислотных остатков, имею­ щих различный к а ж у щ и й с я удельный объем, приводит к тому, что присоединение каждого нового аминокислотного остатка мо­ жет изменить величину составного объема как в положительную, так и в отрицательную сторону. Предельными величинами объема белка являются 0,579 см3 /г для поли-асп и 0,884 см3 /г для поли-лей или поли-илей (см. табл. 7). У природных белков, имеющих гете­ рогенный состав аминокислотных остатков, среднее значение ка­ жущегося удельного объема белка по данным табл. 8 равно 0,728 см3 /г. Средняя величина составного объема равна 0,717 см3 /г, что очень близко к средней величине объема аминокислотногоос­

в расчете объема малого пептида будет существен еще и учет об­ разования дополнительного заряда в месте разрыва пептидной свя­ зи. Состав малого пептида определит, в к а к у ю сторону изменится составный объем основной молекулы. Например, на рис. 40 пока­ зан случай его уменьшения.

Небольшая добавка к составному объему белка проявляется уже при образовании первичной структуры . Было показано [76, 141—143], что сближение заряженных боковых радикалов амино­ кислотных остатков, завершающееся образованием пептидной свя­ зи, приводит к небольшому уменьшению электрострикционного эффекта (на ~ 3 см3 /моль), т. е. увеличению объема. Поэтому на

вичной структуры . Наличие пространственной структуры полипеп­ тидной цепи может способствовать дополнительному сближению радикалов и соответствующему увеличению объема, т. е. попада­

водит к увеличению объема системы (следовательно, и кажущегося объема растворенного вещества), ка к например в случае иативного тропоколлагена [67], флагеллина [81], белка вируса табачной мо­ заики [201], Г-актина [207]. Это значит, что даже в системе свобод­ ных молекул, обладающих большим числом степеней свободы, чем атомные группы макромолекулы, не достигается максимально плотная упаковка . Особенно в случае глобулярных белков обра-

88

зование глобулы из полипептидной цепи является как бы внутри ­ молекулярной агрегацией, которая тем более может приводить к увеличению объема за счет образования пустот в пространствен­

конформацню. Многообразие возможных условий и состояний

щих различные физико-химические реакции, в том числе при кон­ формационных переходах белков:

деспирализации поли-Ь-глутаминовой кислоты и поли-Ь-лизина

веденной с помощью модифицированного метода Кона — Эдсалла . Все многообразие изменений объема при переходе белка из од­

числе ковалентных связей. В этой ж е области разместятся и ожи­ даемые изменения объема при конформационных колебаниях б е л ­ ков, например, актомиозинового комплекса [236, 237].

80