Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

книги из ГПНТБ / Замятнин, А. А. Дилатометрия растворов белков

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

19.10.2023

Размер:

4.77 Mб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 78 / 118 9 10 11 > Следующая >>>

я х . Основываясь на том, что с повышением температуры (до 50— 60°) водородные связи ослабляются, а гидрофобные взаимодей ствия усиливаются [50, 216], можно считать, что при образовании «прямого» геля (желатины) происходит резкий сдвиг п р и данной температуре в пользу образования межмолекулярных водородных связей, и это сопровождается отрицательным объемным эффектом. В случае актомиозина, видимо, при золь-гель переходе происхо дит резкий сдвпг в сторону увеличения числа гидрофобных взаимо действий, что сопровождается положительным объемным эффек том. Естественно, что в случае к а к «прямого», так и «обратного» г е л я в образовании структуры могут принимать участие и водород ные связи, и гидрофобные взаимодействия. Характер геля опреде ляется преобладающим в нем типом связей.

В случае правильности данных рассуждений межмолекуляр ные связи при агрегации в рассмотренных примерах должны опре деляться в основном гидрофобными взаимодействиями. Однако не исключена возможность наблюдения отрицательного объемного эффекта при агрегации, если в этом случае определяющими меж молекулярными связями окажутся водородные.

V I

В Ы Ч И С Л Е Н И Е К А Ж У Щ И Х С Я О Б Ъ Е М О В А М И Н О К И С Л О Т И Б Е Л К О В

КАЖУЩИЕСЯ ОБЪЕМЫ АМИНОКИСЛОТ

К а ж у щ и е с я объемы аминокислот и аминокислотных остатков обыч но рассчитывают, пользуясь значениями к а ж у щ и х с я атомных объ

емов, найденных	Траубе .	Н а стр.	16 были приведены величины
атомных объемов	всех	основных	химических элементов, встре

чающихся в белках . Основываясь на этих данных, можно получить

значения объемов атомных групп,

составляющих

аминокислоты,

а,

следовательно,

объемы

белков.

Сложение

соответствую

щих

величин атомных объемов

дает

значения объемов

главных

атомных

групп, из

которых

составлены

аминокислоты

и белки

(табл.

3).

Т а б л и ц а

Величины кажущихся объемов главных атомных групп,

встречающихся

в белках [14]

Характеристика

— NH,

- с н 2

- с о о н

- C O N H

ОН

Мольный

объем

7,7

16,3

18,9

20,0

5,4

Мольный

вес

16,0

14,0

45,0

43,0

17,0

Удельный

объем

0,48

1,16

0,42

0,47

0,32

* Вместо 16,1 см^моль [іі,

12] Коном и

Эдсаллом взята данная

величина

[14,

16, 17].

Е с л и сравнивать

экспериментально

определенные

величины

к а ж у щ и х с я

мольных

объемов электрически нейтральных соедине

ний, растворенных в воде, с суммой объемов их атомных групп,

то

неизменно экспериментальная

величина (Ф 3 )'оказывается

больше

теоретической (Фт ),

к а к это видно из табл. 4.

Д л я

большинства

таких

соединений

связь

между

Ф э

Ф т

обычно подчиняется

выражению:

ФЭ =

ФТ +

Ф„ 0 .

(33)

где

Фко

—

величина,

н а з в а н н а я

Траубе

кообъемом.

Б ы л о показано, что кообъем от молекулы к молекуле меняется

мало,

его

значение

лежит

в пределах

1 1 — 1 5

см3 /моль,

						Т а б л и ц а 4
Экспериментальные и теоретические величины кажущихся мольных
	объемов (в см3 /моль) электрически нейтральных соединений
		Вещество	фЭ	фТ	фЭ _ фТ	Литературные
						ссылки
Метанол		CHs—ОН	37,0	24,6 .	12,4	[13]
		CHs—ОН
Уксусная		кислота	50,7	38,1	12,6	[13]
		СИ»—СООН
Амид	гликолевой кислоты		56,2	42,7	13,5	[21]
		НО—СНа—CONHa
Амид	молочной кислоты		73,8	58,8	15,0	[14]
		СНз—СН—CONHa
		j
		ОН
расчетах часто принимают
Ф 1 ; о =		13 см3 /моль				(34)

(когда рассматриваются не аминокислоты). Величину кообъема Траубе считают обусловленной межмолекулярными взаимодей ствиями, которые ответственны за минимальные расстояния меж ду молекулами в жидкости [13, 14].


Однако в случае диполярных ионов оказалось,								что теоретиче
с к а я и экспериментальная величины кажущегося мольного									объема
очень близки друг		к	другу. Например,			у	незаряженного		амида
гликолевой	кислоты		и	его изомера — глицина,				являющегося
диполярным	ионом,		величины		экспериментально			определенных
к а ж у щ и х с я	мольных			объемов	равны	соответственно			56,2 и
43,5 см3 /моль	[21]. К а к			видно из табл. 4, Ф э			глицина весьма бли
зок к Ф т амида гликолевой кислоты. Эти						совпадения были			найде
ны д л я широкого		класса соединений, я в л я ю щ и х с я						диполярными

ионами . Интересующие нас составные части белка — аминокисло

ты т а к ж е подчиняются			этому п р а в и л у . Н и ж е приведены			теорети
ческие и экспериментальные				величины к а ж у щ и х с я	мольных объ
емов нескольких диполярных аминокислот [16].
Аминокислота		ф 3	ф т	- Аминокислота	фа	ф т
Глицин		43,5	4 2 J	Валин	91 ] 3	с ц п
Алании		60,6	58,8	Лепщш	107,5	Ю 7 , 1
Т а к и м образом,		для диполярных ионов не нужно учитывать
кообъем	Траубе и,	следовательно,
Ф э	Ф т .					(35)

Это совпадение объясняется тем, что электрострикциониый эф

фект, обусловленный наличием у аминокислот заряженных							амин-
ных и карбоксильных групп, по величине примерно						равен,	а по
знаку противоположен кообъему Траубе .
В случае тетраполярных соединений, каким, например,							я в л я
ется лпзил - глутаминовая кислота
+ H3 N—СІ-Із—СШ—СІЬ—СІ-Ь—СН—соо-
- О О С - С І Ь — С І Ь - С Н - С О — N H
				I
				NH3 +
равенство (35) не выполняется, а
Ф Э <	Ф Т ,						(36)
поскольку в данном случае имеется					дополнительный] электро-
стрикционный			эффект, обусловленный		еще двумя	заряженными
группами		[13].
Из	рассмотрения объемных эффектов на уровне					аминокислот
очевидно, что в общем случае
Фэ\=	Ф Т +		+	Е,			(37)
где Е	— величина			объема, соответствующая электрострикцион-
ному эффекту. Д л я				аминокислот обычно принимают
Ф к о	=	+14,1	см3 /моль,				(38)
£	=	—13,3	см8 /моль.				(39)

При расчете объема молекулы белка необходимо использовать аминокислотные остатки, объемы которых, очевидно, должны от личаться от объемов аминокислот. П р и переходе от объема амино кислоты к объему аминокислотного остатка необходимо учитывать следующие три обстоятельства [217].

Во-первых, объем каждого аминокислотного остатка меньше объема аминокислоты на величину объема одной молекулы воды, т. е. Ф т станет меньше на 6,6 см 3 /моль (единственную молекулу воды на концевых аминокислотных остатках при достаточно боль шой длине полипептида, очевидно, можно не принимать во вни мание) .

Во-вторых, при образовании пептидной связи исчезают п а р ы зарядов на участвующих в связи карбоксильных и аминных груп

пах аминокислот, что приводит к		ликвидации	электрострикцин,
обусловленной этими парами	зарядов, т. е. объем увеличится на
13,3 см 3 /моль .
В-третьих, член кообъема	Ф к о	в уравнении	(37)	необходимо
опустить, так как аминокислотный остаток не является				индивиду

альной молекулой, что д л я аминокислоты даст уменьшение объ ема на 14,1 см 8 /моль . Эту величину н у ж н о было бы добавить к объ ему всей молекулы белка, но поскольку она пренебрежимо мала

4 А. А. Замятнин

по сравнению с полным объемом белка, ее можно не учитывать совсем.

Т а к и м образом, для величины кажущегося мольного объема аминокислотного остатка имеем

ф 1 О = Ф А - Ф Н	, О - Я - Ф „ О			(40)
или
Ф А О '•= Ф А —6 ' 6	+ 1 3 ' 3 —	=	Ф А — 7 - 4 см3 /моль.	(41>
В табл. 5 приведены		значения к а ж у щ и х с я		мольных объемов
аминокислот, полученных			экспериментально	(Фд), и аминокис

лотных остатков, вычисленных по уравнению (41), т. ѳ. Фао- За метим только, что для аминокислотных остатков лизина и аргинина

величина Е взята		равной —18 см3 /моль. В этой таблице				даны так
же теоретические		значения к а ж у щ и х с я мольных объемов амино -
					Т а б л п ц а
Кажущиеся мольные и удельные объемы аминокислот (А)
	и аминокислотных остатков (АО) [217]
Аминокислота			<	ф А О	ф А 0	Фѵ см'/г
				смЛ'моль
Глицин			43,5	36,1	36,3*
Аланпп			60,6	53,2	52,6*
Валпн			92,7	85,3 .	85,2*
Лейцаи			108,4	101,0	101,5*
Нзолейцпн			108,4	101,0	101,5*
Фенплаланіш			121,3	113,9*
Пролип			81,0	73,6*
Триптофан			144,1	136,7*
Серии			60,8	53,4	54,9*
Треоиші					71,2*
Метиошш			105,1	97,7*
Цпстин					128,8*
Аспарагин			78,0	70,6*	72,6
Глутамин			93,9	86,3*	88,9
Аспарагиновая кислота			74,1	66,7	68;4*
Глутаминовая кислота					84,7*
Тпроз'иц			123,6	116,2*
ГИСТИДИН			99,3	91,9*
Лпзнп			108,5	105,8	105,1 *
Аргпннп					109,1 *
* Величины,	использовавшиеся для		вычисления	кажущегося	удельного	объема ами-
ПОІСІСЛСТНОГО	остатка (0^).

кислотных остатков (Фло)> вычисленных по данным табл. 3, соглас но уравнению

Ф І 0 = Ф А — 6 > 6 см3 /моль.

(42)

Приведенные в табл. 5 величины широко используются для вы числения кажущегося удельного объема белка в случае, если и з вестен его аминокислотный состав.

РАСЧЕТНЫЙ МЕТОД КОНА—ЭДСАЛЛА [217]

В настоящее время величину кажущегося объема белка опреде ляют экспериментально й расчетным путем. Первый из них состо ит в измерении плотности раствора белка и последующем вычис лении объема. Д р у г о й метод заключается в расчете этой величины из объемов аминокислотных остатков, составляющих белок. Часто при исследовании физических свойств нового белка, аминокислот ный состав которого еще неизвестен и когда в распоряжении экс периментатора имеется микроскопическое количество материала,

величину		к а ж у щ е г о с я	удельного объема		принимают		равной
0,75 см3 /г без к а к и х бы то ни было измерений и оценок. Это							объяс
няется тем, что к а ж у щ и е с я				удельные объемы большинства			белков
лежат	в	пределах величин		0,70—0,76 см3 /г, и		в большинстве
«лучаев	ошибка 6—7%		не	рассматривается	к а к	слишком	б о л ь
ш а я .
Широко используется метод расчета кажущегося объема							белка,

который предложен Коном и Эдсаллом в 1943 г. [217]. Этот метод

основан на представлениях Траубе [11, 12] об аддитивности			моль
ных объемов атомов и атомных групп (в нашем случае		аминокис
лотных остатков).
Чтобы рассчитать по этому методу	к а ж у щ и й с я объем		белка,
леобходимо знать его аминокислотный состав и к а ж у щ и е с я			объе
мы аминокислотных остатков.
Пусть рассматриваемый нами белок содержит щ молей і-го
аминокислотного остатка, имеющего	мольный вес МІ	И	к а ж у
щийся мольный объем Ф І . Тогда к а ж у щ и й с я мольный		объем все
го белка Фб будет равен

где суммирование производится по всем видам аминокислотных •остатков, общее число которых к (для большинства белков к =

=20).

Далее, поскольку молекулярный вес белка равен

Мб=	J n.M.,	-	(44)
	і=1

следовательно, к а ж у щ и й с я удельный объем его определяется выражением

		к
		2 П.Ф.
Ф5 =	и г	= a	•		(
		i = l
Однако из		практических		соображений д л я вычисления к а ж у
щегося	удельного		объема	белка	обычно пользуются не уравне
нием (45), а		вводят	величину Wi,		я в л я ю щ у ю с я весовым процен

том соответствующего і-го аминокислотного остатка. Тогда учи тывая, что, согласно формуле (18),

		(18* >
объем	100 г белка	будет равен
і=і
а его к а ж у щ и й с я		удельный объем
^	= - ± J T ö ö — •	(46

Применение уравнения (46) предполагает знание полного ами нокислотного состава белка, точный анализ которого не всегда уда ется сделать. Поэтому д л я вычисления кажущегося удельного объ ема пользуются чаще всего формулой:

ф5=—к	.
і=1
к
причем при S Wi	- > 100 возможная ошибка в определении 0 б ,

вообще говоря, снижается.

В формулу (47) могут входить данные только об аналитически определенных объемах аминокислотных остатков. Если же все

величины Wi	известны, то уравнения (46)		и (47) становятся иден
тичными, поскольку в этом случае
к
2 РГ. = 100.			(4
І = І
З н а ч е н ия	к а ж у щ и х с я удельных	объемов 0* ряда белков, вы
численные из	их аминокислотного	состава,	сравнивают с величи-

нами 0 G , полученными из экспериментов по измерению	плотно
сти [15, 43, 192, 217—219]. Н и ж е приведены удельные	объемы,

белков (в см3 /г), полученные экспериментально и рассчитанные

методом Кона — Эдсалла				[219].
Белок				0 о	Белок

Фиброин	шелка,		0,701	0,689	Zn-Инсулин		0,735	0,724*
суспендированный!					d-Глицѳральдегид- 0.737 0,743
в воде					фосфатдегидро-
РНКаза			0,709	0,703	гепаза
Шерсть,	суспеидп-		0,716	0,712	Альдолаза		0,740	0,743
роваппая в		воде	0,722	0,717	ß-Казеип		0,741	0,743
Лпвоцим					Яичный	альбумин	0,7479	0,738
Фибриноген		(чело	0,725	0,723
					Гемоглобин (лоша		0,749	0,741**
века)					ди)
а-Ка8еин			0,728	0,725
					ß-Лактоглобулин		0,751	0,746
Химотрипсипоген			0,73	0,734
					Токсин	сибирской	0,75	0,736
Казеин (нефракцн-			0,731	0,731
					язвы
онированный)					Желатина		0,695	0,707
Сывороточный аль			0,7343	0,734
					Эдестпи		0,744	0,719
бумин (быка)

•Удельный объем цинка не учитывался. Удельный объем гемина не учитывался.

Из приведенных данных видно, что в большинстве случаев теоретические величины в целом удовлетворительно согласуются с экспериментальными, несмотря на то, что метод основан на целом ряде допущений [220, 221].

ПРИБЛИЖЕНИЯ МЕТОДА КОНА—ЭДСАЛЛА

С 1952 г., когда были опубликованы результаты по сравнению экс-; периментальных и теоретических величин удельных объемов бел-* ков [219], большие успехи достигнуты в области повышения чис-. тоты препаратов белков, в анализе их аминокислотного состава и экспериментальном определении весьма точных значений их удельных объемов. Поэтому нами была предпринята попытка [220, 221] проанализировать применимость расчетного метода Кона — Эдсалла [217] в свете новых данных.

Использование метода Кона — Эдсалла для расчета к а ж у щ и х ся удельных объемов ряда разнообразных белков [219] показало, что этот метод дает удовлетворительные результаты, несмотря на то, что он основан на целом ряде допущений.

Величины фі (табл. 5), обычно используемые [15, 43, 192,'

217—219] дл я нахождения 06,		получены двумя способами.	Преи
мущественно	они рассчитывались из величии к а ж у щ и х с я		моль
ных объемов	аминокислотных	остатков Ф г согласно значениям

к а ж у щ и х с я атомных (см. стр. 16)		и к а ж у щ и х с я мольных	объемов
атомных групп (табл. 3), составляющих аминокислотные			остатки,
и принципу аддитивности	Траубе	[11, 12]. Однако в целом ряде
случаев для этого брались	величины Ф ; , полученные из		соответ

ствующих найденных экспериментальным путем к а ж у щ и х с я моль ных объемов аминокислот. Заметим, что сюда относятся и некото рые аминокислотные остатки, несущие з а р я ж е н н ы е группы в бо ковых радикалах (например, тир и гис). При переходе от амино кислоты к аминокислотному остатку Кон и Эдсалл учли измене ние свойств тех аминов и карбоксилов, которые включаются в по липептидный скелет молекулы белка согласно формуле (41). Изменение объема при таком переходе, связанное с изменением окружения боковых радикалов аминокислотных остатков, не уч тено совсем. Правомерность неучета в данном методе электрострик-

ционного эффекта, возникающего	при взаимодействии з а р я
женных групп боковых радикалов	аминокислотных остатков, уже

неоднократно обсуждалась в литературе [15, 42, 43, 149, 217, 219, 222], и мы специально на нем останавливаться не будем.

Рассмотрим ряд конкретных величин 0 ; полученных некор

ректно, но используемых при расчете 0 О .

К а ж у щ и й с я удельный объем цистинила первоначально был рас считан из величины 135,4 см3 /моль [217]. Позднее [192] эту величи ну вычитанием объема 6,6 см3 /моль, обусловленного отщеплени ем второй молекулы воды при встраивании аминокислотного ос татка в полипептидную цепь, исправили на 128,8 см 3 /моль . Однако


расчет	мольного объема группы С Н 2 по величинам		атомных	объ
емов (см. стр. 16) дает значение 16,1 см3 /моль, а из			эксперимента
[16, і7] следует, что ее среднее значение составляет			16,3 см 3 /моль
(табл. 3). Н а основании этого дл я цистинила можно получить				з н а
чения от 129,2 до 130,0 см3 /моль. Кроме того, присутствие в				бел
ках не только цистинила, но и цистѳинила никак		не отражено в
расчете	величины фо. Причиной того, что такое	упрощение мо

жет не оказывать существенного в л и я н и я на результаты расчетов к а ж у щ и х с я удельных объемов белков, служит малое процентное


содержание в белках как тех, так и других серусодержащих					а м и
нокислотных	остатков.
По той же причине неопределенности в величине мольного объ
ема группы	С Н 2 значение кажущегося мольного объема			л и з и л а
заключено в пределах 105,1—106,1 см3 /моль, а аргинила —				108,1—
108,9 см3 /моль (а не 109,1 см3 /моль, как указано в табл. 5).
Те же соображения можно привести в отношении величин к а
ж у щ и х с я мольных объемов всех других аминокислотных					остат
ков, рассчитываемых		теоретически.
Следует	также отметить, что в случае		кажущегося удельного
объема триптофанила		правильнее было бы использовать		значение
не 0,74, а 0,73 см3 /г,		которое получается	прямо из величины ка
жущегося мольного объема триптофанила,			равной 136,7	см 3 /моль

										Т а б л и ц а 6
Экспериментальные				и теоретические величины				кажущихся		удельных
		объемов		белков при 25°С (в см3 /г) [220, 221]
Номер			Белок			06		06		0 6 - 06
1	РНКаза *					0,704 [20]		0,711	[224]	—0,007
2	Лизоцпм *					0,719	[149]	0,717	[224]	+0,002
3	Миозпи	(кролика)				0,727	[225]	0,736	[226]	—0,009
4	Легкий	меромиозии,			фракция	0,726	[227]	0,733	[226]	-0,007
	I (кролика)								[226]
5	Тяжелый меромпозип				(кролика)	0,735 [227]		0,738	[226]	—0,003
6	Тропошіозии (кролика)					0,736	[222]	0,731	[226]	+0,005
7	Актин (кролика)					0,719 [228]		0,732	[226]	—0,013
8	Креатиикпназа (кролика)					0,747	[229]	0,735	[229]	+0,012
9	Мпокиназа		(кролика)			0,732	[230]	0,742	[224]	—0,010
10	Т-Глобулпп		(человека)			0,744 [231]		0,730	[224]	+0,014
11	Сывороточный альбумин (быка)					0,736	[149]	0,736	[224]	0,000
12	Яичный	альбумин (курицы)				0,746	[149]	0,737	[224]	+0,009
13	Желатина (кожи свиньи) **					0,696	[149]	0,704	[224]	—0,003
14	Эдестпн	(семян		конопли)		0,724	[149]	0,719	[224]	+0,005
15	Флагеллии		(Proteus		vulgaris)	0,729	[232]	0,725	[226]	+0,004

•Для определения экспериментальных значений фд использовались промышленные препараты белков.

•• Кажущийся удельный объем присутствующего в желатине оксилизила был полу чен из кажущегося мольного объема лизила прибавлением к нему 2,3 см'.моль, отвечающих добавлению одного гидроксильного кислорода.

(табл. 5). Процентное содержание триптофанила в белках обычно невелико, и у к а з а н н а я ошибка вряд ли может играть существен ную роль при расчете величины ф%.

У большинства белков пока неизвестно распределение амидвого азота между глутаминилами и аспарагинилами. Поэтому еще од ним допущением метода Кона — Эдсалла я в л я е т с я то, что обычно в белке предполагается наличие только глутаминилов, что соглас но данным табл. 5 может приводить к несколько заниженным зна чениям ф\. Однако больших ошибок при этом не возникает. На пример, дл я белков 3—8 в табл. 6 нами были проведены расчеты 0б вообще без учета амидного азота и в предположении, что весь он сосредоточен в глутаминилах . Во втором случае значения фі

всегда были, больше на 0,001	см3 /г, чем в первом. Поэтому для про
чих белков (за исключением	Р Н К а з ы и лизоцима) мы рассчиты

вали сначала величину кажущегося удельного объема без учета амидного азота и к результату добавляли 0,001 см3 /г. В табл. 6 п р и ведены данные, полученные таким способом. Очевидно, что в слу чае содержания амидного азота только в аспарагинилах увеличе ние ф}, будет не более, чем на 0,001 см3 /г.

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 78 / 118 9 10 11 > Следующая >>>

Соседние файлы в папке книги из ГПНТБ