Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

книги из ГПНТБ / Замятнин, А. А. Дилатометрия растворов белков

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

19.10.2023

Размер:

4.77 Mб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 67 / 117 8 9 10 11 > Следующая >>>

К а к мы увидим далее, объемные эффекты сопутствуют самым разнообразным коиформационным перестройкам в белках. П р и этом изменение процента спиральности может быть частью всей копформационной перестройки (например, при денатурации [151]) . Т а к и м образом, сведения о вкладе объемного эффекта за счет изменения спиральности будут способствовать пониманию при чин проявления полного объемного эффекта при конформацпоиных перестройках в белках.

Переход клубок - спираль исследовали дилатометрически в водных растворах [80, 179] и в органических растворителях [180] . Полученные результаты свидетельствуют о наличии объемного эффекта, характеризующегося вполне определенным знаком и ве личиной, зависящей от вида полипептида.

Н а	рис. 32 изображены	кривые, иллюстрирующие		переход
клубок - спираль поли-Ь-глутампновой кислоты в			присутствии
NaCl	[80] . Переход вызывали	титрованием раствора	с	помощью


0,5 M H C l . Представленные кривые характеризуются двумя		изло
мами при	p H 8 и р Н ' 5 , 8 , между которыми, согласно данным ре
фрактометрии, происходит конформационная перестройка.		Поло
жительный	объемный эффект, соответствующий этой области p H ,

пытались объяснить нейтрализацией карбоксильных групп боко


вых		радикалов	аминокислотных		остатков	полипептида		вводимы
ми	в	среду протонами.		Однако	эффект	этой	реакции,	равный
+	11	С М 3 / М О Л Ь ' І Н + [78, 7 9 ] , оказался меньше					наблюдаемого.		По
этому полученное добавочное увеличение объема							было предложено
считать обусловленным 100 % - н ы м переходом							полипептида		из
клубкового состояния в спиральное^ Оно составляет + 1 , 1								см 3 /моль
аминокислотного			остатка	или,' в данном примере, + 8 - Ю - 3 см3 /г,

причем увеличение концентрации NaCl ведет к снижению величи ны объемного эффекта. Рассмотренные результаты дилатометри ческих исследований поли-Ь-глутаминовой кислоты хорошо со гласуются с данными, полученными расчетным путем из рефракто

метрии [181] .

Т а к и м ж е я р к и м		примером	является		объемный эффект,	сопро-
в о ж д а ю щ и й	переход	клубок - спираль		у	полп-Ь-лизпна, который
титровали	с помощью 0,5 M		NaOH	в	присутствии NaBr	[179].

И в этом случае (рис. 33) обнаружены три зоны рЫ, средняя из которых (pH 9,8—10,5) является областью перехода. Объемный эффект, соответствующий этой области, также не может быть объяснен нейтрализацией зарядов в процессе титрования поли


пептида (нейтрализацией аминпых		групп боковых	радикалов
аминокислотных остатков полипептида с помощью			групп О Н - ,
сопровождающейся положительным		объемным эффектом 17—
20 см3 /моль	О Н - [79]). Наблюдающееся дополнительное			увеличе
ние объема	в области p H 9,8—10,5,	ка к и в предыдущем		случае,

считают обусловленным 100%-ным переходом из клубка в спираль.

Этот объемный эффектможет достигать	величины +1, 9 с м 3 / м о л ь
аминокислотного остатка или, в данном	примере, + 1 , 5 - Ю - 2 см3 /г,

•причем увеличение концентрации	соли (NaBr) также приводит
к снижению величины объемного	эффекта.

Вслучае поли-у-беизпл-Ь-глутамата объемный эффект получен

всмеси дихлоруксусной кислоты и дихлорэтана (взятых в отно шении 3 :1) при изменении температуры [180]. Н а рис. 34 видна •область перехода, которой соответствует отрицательный объемный эффект —3 • Ю - 3 см3 /г при 30° С. Однако отрицательную величину эффекта нельзя, видимо, считать противоречащей данным, по лученным в случае поли-Ь-глутамииовой кислоты и поли-L- лизина, поскольку различие природы использовавшихся раство рителей, по нашему мнению, вряд ли может давать повод к про тиворечию.

Внастоящее время дилатометрические исследования искус ственных полипептидов распространяют и на изучение перехода клубок — ß - форма [182]. Образование ß-структуры в этом случае характеризуется увеличением объема, составляющим ~ Ю - 2 см3 /г. Однако в настоящее время, по-видимому, эти результаты еще рано

использовать для объяснения объемных эффектов в белках.

ДЕНАТУРАЦИЯ

Дилатометрически

исследовали

тепловую

денатурацию

белков

i l денатурацию, вызванную рядом

различных

химических

аген

тов.

Первые

исследования

тепловой

денатурации были

выполнены

на

дилатометрах

малой

чувствительности

[21, 62,

183].

Кроме

того, в этих экспериментах раствор

белка

я в л я л с я

еще

инди

каторной жидкостью, заполнявшей

к а п и л л я р , в результате

чего

изменение его вязкости, поверхностного натяжения и ряда

дру

гих

свойств

могло

оказывать влияние на уровень мениска

в ка

п и л л я р е . В

этих

работах

объемный

эффект не

был

обнаружен .

Объемный эффект при

тепловой

денатурации

впервые

наблю

д а л

Хейман

[71], использовавший

дилатометр с ртутью

качестве

капиллярной жидкости. Денатурации подвергались яичный и сывороточный альбумин, сывороточный глобулин и зеип, находив шиеся при 80° С в течение 30 мин, а наблюдения за объемом про

изводились	при	23° С до	и после нагрева.
К а к видно из		табл. 2,	все белки, кроме зеииа (который не коа
гулировал),	при	денатурации в изоэлектрической зоне п р о я в л я

ют положительный объемный эффект порядка 2 - Ю - 3 см3 /г. В слу


чае яичного альбумина по обе стороны от изоэлектрической					точки,
где	коагуляция		не наблюдается, объемный эффект	составлял зна
чительно		меньшую величину.
	Аналогичный результат был недавно получен на коллагене и
желатине		[68].	Увеличение объема при тепловой денатурации
коллагена		составляло 6 — 9 - Ю - 3 см3 /г. В случае химотрипснноге-
на	денатурация		также приводила к увеличению	объема	[184].

							Т а б л и ц а 2
		Объемные эффекты			при денатурации		белков [71]
.	•	"					Объемный	эффект
				Молекуляр			Объемный	эффект
		Белой		Молекуляр		pH
		Белой		ный вес		pH	сма /г • І0-*	см3, моль
							сма /г • І0-*	см3, моль
Сывороточный			альбумин	67	000	5,0	2,0	134
Сывороточный			глобулин	170 ООО		5,6	1,7	283
Яичный		альбумип		44 ООО		4,9	2,3	105
Зеин	(в 90%-иом спирте)			50 000			0	0

Однако	известен	случай отрицательного	знака объемного эффек
та при	тепловой	денатурации белка	[185].

Данные по положительному объемному эффекту при тепловой денатурации белков подтверждаются результатами по изучению «прессориой коагуляции», наблюдающейся под действием высо ких давлений. Из них следует, что высокое гидростатическое давление часто замедляет скорость необратимой денатурации различных белков, наступающей при температуре, близкой к точке коагуляции [143, 148, 186, 187].

Реконструкция белковой молекулы может происходить с раз рывом одних внутримолекулярных связей и с образованием дру гих. Поэтому интересно было получить сведения об изменениях


объема в	системах,	куда добавлен			химический		реагент, конкури
рующий	за внутримолекулярные				связи .	Такими		реагентами,
например,	являются		мочевина и солянокислый				гуанидии.
Б ы л о показано, что в присутствии мочевины происходит зна
чительное	изменение		объема.	Денатурация		38% - ной		мочевиной
ß-лактоглобулина		[147, 148,		151,	152], а	яичного		альбумина
6—8 M мочевиной [150] вызывала уменьшение объема приблизи
тельно на	250 см3 /моль ( ~ 7 - Ю - 3				см3 /г).

Дилатометрическое исследование денатурации сывороточного альбумина [188] солянокислымгуанидиномпривело к более сложным результатам. Оказалось, что при концентрации денатурирующего

агента, равной 2 М , происходило увеличение объема на 90	см3 /моль
( ~ 1,5• 1 0 - 3 см3 /г), а при повышении его концентрации	до 3,8 M

величина объемного эффекта снижается и даже дает отрицатель

ную величину	— 15 см3 /моль ( — 2 - Ю - 4 см3 /г).
Н а рис. 35	приведены кривые, характеризующие объемные

эффекты, которые сопровождают денатурацию белков мочевиной [176]. В зависимости от концентрации денатурирующего агента объемный эффект для сывороточного альбумина и мпоглобина су щественно изменяет свою величину и даже знак (в случае сыво роточного альбумина). В то ж е время для апомиоглобина объем ный эффект в данной области концентраций мочевины практически

остается неизменным. Эти эф

фекты

отражают

изменения

структуры изучавшихся

белков.

Уменьшение объема

миоглобина

при

концентрациях

мочевины

больше, чем 6 М, указывает

на

то,

что

системе

происходит

переход спираль - клубок, харак

теризующийся

отрицательным

объемным

эффектом

[80,

179].

В случае

апомиоглобина

удале

ние гема

также

приводит к

де-

4 L

спирализации, что отражается на

его объеме по сравнению с мио-

концентрация

мочевины, моли

глобином.

По мнению

авторов,

Р и с . ."5. Изменение объема, сопровожда

при денатурации

сывороточного

ющее денатурацию белков с помощью моче

альбумина

мочевиной

[176]

вины при 30° С

1 — миоглобин;

2 — сывороточный

альбу

солянокислым

гуанидином [188]

мин быка;

3 — апомпоглобнн

происходит

образование

не

скольких

форм

денатурирован

ного белка, обладающих различными объемами. Н а л и ч и е этих различных форм должно объяснить характер соответствующей кривой на рис. 35.

Подобные исследования проведены недавно т а к ж е на л и з о - цпме [189, 190], яичном альбумине [190], химотрипсиногене [191].

Изменения объема можно наблюдать при денатурации белка,

применяя и более простые по составу	агенты. Существенную роль
в изменении состояния белка играет	связывание и освобождение

протонов кислыми и основными группами макромолекулы . В л и я ние на объем белковой молекулы может оказать также присут ствие в системе неорганических ионов. В этих случаях объемные эффекты зависят от связывания ионов и от изменения структуры белка. Дилатометрическому исследованию этих воздействий по священо большое количество работ и обзоров [20, 40, 78, 79, 136,

137, 151, 169,	192 - 200] .
Первые дилатометрические		результаты по связыванию белка
ми ионов Н +	и О Н - [136, 137, 169] показали, что объемные эф
фекты по порядку величины		совпадают с темп, которые наблю
д а ю т с я при связывании этих		ионов простыми веществами, содер

жа щ и м и аминные и карбоксильные группы.

Вдальнейшем Козман с сотрудниками [40, 78, 79, 199, 200], используя двухпузырьковый дилатометр, изучили протонирование белков более подробно. Б ы л о показано, что добавление кислоты (HCl) и щелочи (NaOH) в систему, содержащую изоэлектрический

белок (яичный альбумин, сывороточный альбумин,	Р Н К а з у ,
лизоцим, химотрнпсин, гемоглобин, пепсин), приводит	в широ

кой области p H к появлению положительного объемного эф фекта .

П ри этом реакция

—СОО- + Н + - » — СООН

(31)

сопровождалась увеличением объема в среднем на 11 с м 3 / м о л ь Н + , а

—NH+ + O H - - » — NHa + HeO	(32)
на 17—20 см3 /моль О Н " . Однако	при выходе из области p H , где

белок сохраняет свою нативнуіо конформацию, наблюдаются до полнительные объемные эффекты, которые характеризуют именно процесс изменения конформации белка.

В результате проведенного краткого рассмотрения можно сде лать вывод о том, что в автономной белковой системе денатурация

приводит к такому		перераспределению внутримолекулярных свя
зей, что структура		белкового раствора в большинства случаев
становится ка к	бы	более	рыхлой.
Причиной наблюдаемого положительного объемного эффекта
может я в л я т ь с я	образование большого числа внутримолекуляр
ных полостей, недоступных дл я растворителя.
Введение в контакт с			белком денатурирующего агента, спо
собного связываться с различными его группами,				может	приво
дить к различным		видам	взаимодействий и перестроек,		поэтому
знак эффекта трудно заранее предопределить.
			АГРЕГАЦИЯ
Различие между	агрегацией, полимеризацией, Г-Ф переходом и
т. д. в какой-то	степени условно, так как во всех			этих процессах

несколько первоначально независимых молекул белка объединя ются, образуя единую частицу [151]. Пр и этом образование боль ших кинетических единиц, ка к правило, не связано с возникнове

нием ковалептных связей, за исключением тех редких					случаев,
когда	образуются дисульфидные		с в я з и 1 .
Здесь мы кратко разберем объемные				эффекты, сопровождаю
щие известные процессы		такого	рода,	выделив отдельно случай
золь-гель перехода.
Рассмотрение процесса		денатурации		показало, что при коагу
л я ц и и	белков под действием тепла		обычно происходит увеличение
объема	на ~ 2 - 1 0 - 3 см3 /г	[71]. Поскольку к о а г у л я ц и я			является

последней стадией агрегации и приводит к образованию уже макро скопических агрегатов, то такое изменение объема характеризует не только денатурацию, заключающуюся во внутренней пере стройке макромолекулы, но и последующий процесс образования

межмолекулярных			связей. Т а к и м	образом,		если объемные эф
фекты при		агрегации окажутся		достаточно		большими, от них
t
1	ледует	отметить, что в химии полимеров			термин полимеризация ис
пользуют для		случая	ассоциации моиомерных		единиц путем образования
именно ковалептных связей.
1/23	А. А. Замптнин		65

может существенно зависеть величина эффекта, приписываемого денатурации.

Рассмотрим ря д соответствующих примеров.

Полимеризацию белка			виру
са табачной мозаики вызывали
закислением		раствора	с по
мощью HC l в присутствии NaCl
[201]. Величина объемного эф
фекта,	сопровождавшего		про
цесс, составляла + 6 - Ю - 3			см3 /г.
Последующие		измерения	этого
эффекта [202] привели к при
мерно	такой	ж е величине (+5>
• 10 _ 3	см3 /г).	Механизм	прояв
ления	положительного		объем

	S	w	fs		ного эффекта пытались объяс
		Время, мин			нить нейтрализацией				кислотой
Р и с . 36. Объемный эффект (і) и измене					щелочных		групп белка. Однако
ние вязкости	(2)	при* Г-Ф переходе		актина	величина		такого эффекта			оказа
при 25°С [207]
					лась мала для объяснения					пол

					ной	величины		наблюдавшегося
расширения		системы,	что	привело		к мысли о		существовании
структурного эффекта.
Дилатометрически			наблюдали		также агрегацию				нативного
тропоколлагена [67]. Оказалось,					что	этому	процессу		т а к ж е со
путствует	увеличение		объема системы			па 8 • 10~4		см3 /г. Пр и этом
объемный	эффект не зависит от ионной силы и температуры в ин

тервалах 0,2—0,5 и 15—25° соответственно.
Сывороточный альбумин быка претерпевает	агрегацию пр и
65° С. Дилатометрическое исследование этого	процесса в изо-

электрических условиях позволило найти величину объемного


эффекта,	которая, как		оказалось,		имеет	положительный			знак
и составляет		1,2-10~3	см2 /г	[203].
Дилатометрическому исследованию Г-Ф перехода							актина		пред
шествовало		изучение	в л и я н и я высокого давления				на	растворы
Ф-актина	[204, 205]. Б ы л о			показано	[205],	что под		давлением
2500 кг/см 2		Ф-актин в присутствии А Т Ф деполимеризуется.							Этот

результат согласно принципу Л е Шателье позволил авторам пред

положить,	что актин вместе	с окружающим его растворителем в
Г-форме	занимает меньший	объем, чем в Ф-форме. Кроме того,

то, что Г-Ф переходу актина благоприятствует повышение темпера туры [206], свидетельствует об эндотермичности процесса. Этот результат т а к ж е предсказывает возможность существования поло жительного объемного эффекта при Г-Ф переходе.

Чтобы проверить вышеуказанное предположение, И к к а и и др , [207], дилатометрически исследовали Г-Ф переход актина при до бавлении M g C l 2 в присутствии А Т Ф . Параллельно с этим прово дился контроль вязкости среды. Полученные результаты пред-

ставлены на	рис. 36, из которого видно, что с увеличением	вяз
кости, т. е. в	процессе Г-Ф перехода при 25°, объем системы
увеличивается. Небольшой пик у кривой, характеризующей		вяз

кость, по-видимому, обусловлен незначительной примесью о>актинина в растворе актина. Величина полученного объемного эф

фекта прямо пропорциональна концентрации	белка и	с уче
том отрицательного объемного эффекта, сопровождающего		дефос-
форилироваиие А Т Ф [208], составляет +38 1	см3 /моль	(или
+ 7 . 1 0 " 3 см3 /г).

Аналогичные дилатометрические эксперименты были выполне ны с флагеллином из Salmonella abortus-equi [81], претерпеваю

щим в определенных условиях	Г-Ф переход в температурном ин
тервале 22—35° С. Пр и 25° этот	переход сопровождался увеличе
нием объема на 160 см3 /моль (или + 4 - Ю - 3 см3 /г).

Т а к и м образом, выявившаяся область значений объемных эф фектов (от 8 - Ю - 4 дл я тропоколлагена до 7 - Ю - 3 см3 /г дл я актина) свидетельствует о том, что в ряде случаев на величине изменения объема при денатурации ( ~ 2 - Ю - 3 см3 /г) может сказываться процесс агрегации. Поэтому интерпретация соответствующих величин должна проводиться с учетом поведения в данных усло виях конкретного белка.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что все исследован ные к настоящему времени дилатометрически процессы объедине ния белковых молекул в единую структуру сопровождаются уве личением объема. Исключение составит лишь один вид золь-гель перехода, к рассмотрению которого мы переходим.

ЗОЛЬ-ГЕЛЬ ПЕРЕХОД

Объектами дилатометрического исследования при изучении зольгель перехода были желатина [65, 70, 158, 171, 209, 210], небел ковые соединения: агар-агар [211], различные производные цел

люлозы [69, 70, 171, 210] и	другие вещества [70, 82, 171].
Наиболее обстоятельной	в этой области была	работа Хеймана
[70]. Б л а г о д а р я большой	чувствительности	применявшегося

дилатометра Х ѳ йману удалось показать, что золь-гель переход целого ряда различных веществ сопровождается объемным эф фектом.

Гелеобразоваиие желатины достигалось следующим образом. Раствор белка прямо в дилатометре нагревали до 50°, чтобы обеспечить состояние золя . После этого дилатометр помещали

втермостат, где далее он находился пр и 22,5°. Только после

достижения всем дилатометром				температуры термостата		начина
ли	производить отсчет		смещения уровня		индикаторной	жидкости
(ртути) в к а п и л л я р е .			Результаты этих измерений показаны на
рис. 37. Б ы л о		отмечено, что и после того ка к раствор уж е приоб
рел	свойства	твердого	тела,	изменение	объема продолжалось .

Т о л ь ко через 30 час. изменения прекращались полностью. К р и в а я 1 на рис. 37 отражает изменение объема, происходившее в двух опытах. После охлаждения геля в ледяной воде и помещения его снова в тот ж е термостат величина объема возвращалась к прежне му уровню, что отражено кривой 2 на рис. 37. Рассчитано, что п р и переходе золь-гель у желатины происходит уменьшение объема н а - 6 - Ю - 4 см3 /г.

Желатина образует, так называемый, «прямой» гель [171], который формируется при понижении температуры. В противопо ложность этому существуют «обратные» гели, которые формируют

ся при повышении температуры. Примером такого белкового

геля

является

мышечный белок

актомиозии.

Исследование

в л и я н и я

см

высокого гидростатического дав

ления

на

раствор

актомиозина

10,0

[212]

показало, что

данном

случае

золь-гель

переход

дол

9,5 \

жен

сопровождаться

увеличе

нием

объема

на

10~4

см3 /г.

9,0

Е с л и

учесть то, что

при

по

вышении

температуры

объем

8,5

системы,

которая

претерпевает

золь-гель

переход,

увеличива

8,0

ется за

счет обычного

теплового

Часы

расширения

(при

температурах

Р и с .

37. Объемный эффект при золь-гель

выше

4° С),

то

это

явление

вме

переходе у желатины при 22,5° С [70]

сте

с объемным

эффектом

при

Отсчет по

мениску в капилляре

(в

см.)

золь-гель переходе,

осуществля

1 — золь-гель переход; 2 — после

охлаж

емом

изотермических услови

дения

геля

я х ,

схематически

будет

выгля

деть,

как

представлено

на

рис.

38, а и б [6] (коэффициенты теплового расширения

до и после пере

хода

условно

выбраны одинаковыми).

Полученные объемные эффекты при

золь-гель

переходах

объяс

няли

с позиций явления гидратации белка [70,171]. В этом

с л у ч а е ,

учитывая, что гидратация желатины при набухании и растворе

нии сопровождается уменьшением объема на	5 • Ю - 2 см 3 /г,	изме
нение величины гидратации при обоих видах	золь-гель перехода
может составлять ~ 1 % .
Однако такие представления мало говорят о природе связей,
участвующих в образовании гелей. Поэтому	рассмотрим эти	д а н
ные с других позиций.

Одним из условий гелеобразования считают необходимость ограниченной растворимости функциональных групп полимера [213]. Различие растворимости приводит к тому, что одна часть молекулы как бы находится в растворенном состоянии, а другая —

стремится	выйти	из раствора.
Н а основании		данных термографии и светорассеяния был сде
л а н вывод,	что в	начальной стадии гелеобразования происходит

7"°

Р и с . 38. Схематическое	изображение	изменения объема при «прямом»		(а)	и «обрат
ном» (б) золь-гель переходе [б]
образование агрегатов, а затем — связывание их			в	сплошную
пространственную	структуру	[213].
Ч т о ж е касается природы связей, ответственных			за	гелеобразо-
вание, то пока установлено, что аминные, карбоксильные,					гуани -

диновыѳ и гидроксильные группы, по-видимому, не играют при этом существенной роли [151].

Сильное влияние на температуру плавления гелей желатины добавок таких веществ, к а к мочевина, ацетамид, или влияние различных неполярных добавок позволили сделать вывод о том, что межмолекулярное взаимодействие в гелях желатины обуслов лено образованием локализованных (например, водородных) свя

зей,	а	т а к ж е взаимодействиями нелокализованного типа				(напри
мер,	гидрофобными)		[213].
Зависимость величин				объемов от	н а л и ч и я водородных	связей
можно		определить	из	рассмотрения	объемов чистых веществ.

Н а п р и м е р , соединения с межмолекулярными водородными свя зями имеют меньший мольный объем, чем их изомеры с внутри

молекулярными водородными с в я з я м и	(например о-нитрофенол
и ле-нитрофенол) [214]. Увеличение объема наблюдается т а к ж е		при
образовании водородных связей внутри	кристаллогидратов	[215]
и п р и образовании спиралей в растворе	[80, 179].
Кроме того, известно, что расстояние между парой атомов		п р и

наличии водородной связи может составлять от 2,0 до 3,1 À, а если

п а р а связана	ван-дер-ваальсовскими силами, то это	расстояние
больше, а именно 3,1—4,0 Â [27, 50].
П р и н и м а я	во внимание вышесказанное, мы можем	предложить

гипотетическое объяснение существования двух видов перехода золь-гель.

Многообразие групп белка обусловливает возможность участия и х к а к в водородных с в я з я х , так и в гидрофобных взаимодействи-

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 67 / 117 8 9 10 11 > Следующая >>>

Соседние файлы в папке книги из ГПНТБ