книги из ГПНТБ / Замятнин, А. А. Дилатометрия растворов белков

П ри исследовании специфичности аргиназы из печени овцы впер­ вые были количественно связаны процессы расщепления субстрата и изменения объема [57]. G помощью указанного фермента про ­ изводили расщепление равновесового рацемата d- и Z-аргинпыа и одного из оптических изомеров. Д л я характеристики наблюдав­ шегося объемного эффекта было предложено пользоваться вели­ чиной константы сокращения (к), которая характеризует изме­ нение кажущегося мольного объема субстрата при ферментатив­

а также Вебера и Нахмапзона [136, 137], которые явились пред­ посылкой для необычайно тщательных исследований объемных эффектов при протеолизе аминокислот, пептидов и белков, про ­ водившихся под руководством Лнндерштрема - Лапга . В резуль ­ тате таких исследований были получены не только новые данные о

Линдерштрем - Лапг с сотрудниками на основании литературных данных [17, 133—139], а также базируясь на собственных результа­ тах [74, 75, 104, 140], выполненных с помощью модифицирован­ ного двухпузырькового дилатометра, рассмотрели объемные эф­ фекты реакций, в которых происходят различные превращения аминокислот и пептидов [76, 141—143]. В результате этих иссле­ дований оказалось возможным получить величины объемных эф­ фектов, вызванных электрострикцией воды вблизи ионогенных групп растворенных веществ. Средние величины объемных эф­ фектов в системах, содержащих диполярные ионы, такие как аминокислоты и пептиды [140—143], даны ниже:

(4, . . . дип)

50

и карбоксильные группы так близки друг к другу, что пх ре­ зультирующее влияние на окружающие молекулы воды меньше,

пептидов далеко расположенные заряды действуют как индиви­

В табл. 1 даны экспериментально полученные АФ^ значения величии объемных эффектов в реакциях, сопровождающихся образованием ионов и диполяриых ионов аминокислот и пептидов, а т а к ж е величины этих эффектов АФ Т , рассчитанные из данных, приведенных на стр. 50. Заметим, что величина объемного эффек­ та при образовании любой пары аминокислотных ионов везде

изменения электрострикции в реакциях, включающих в себя аминокислоты и малые пептиды, послужили достаточным основа­ нием для экспериментального и теоретического изучения объем­ ных эффектов при гидролизе белков.

ОБЪЕМНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРИ ГИДРОЛИЗЕ БЕЛКОВ

Собранные нами литературные данные свидетельствуют о том, что,

ротки крови. Результаты этих первых опытов свидетельствовали о том, что гидролиз белков сопровождается уменьшением объема. О величинах ж е объемных эффектов судить было трудно, так как начальные стадии реакции из-за несовершенства техники дилато­ метрии оказались недоступными для исследования.

К настоящему времени дилатометрически исследовано доволь­ но большое число белков, подвергнутых гидролизу. П р и этом ос­ новной результат Галеотти о знаке объемного эффекта подтвер­ дился, несмотря на то что исследовавшиеся белки сильно разли ­ чались по составу и молекулярному весу.

Н а рис. 24, а показан процесс изменения объема, сопровож­ дающего протеолиз казеиногена и желатины трипсином [145],

51

Врет, нин. Время, «ил.

V и с . 24. Процесс изменения объема (а) н количества амшшого азота (6) при протеолпзе казеиногена и желатины трипсином [145]

1 — 2%-ньш казеиноген; 2 — 1%-ный казеиноген;Zß '.— 2%-ная желатина; 4 — 1%-ная желатина

между изменением объема-и изменением количества аминного азо­ та представлена на рис. 25. Т а к и е ж е зависимости изображены на рис. 26 для процесса гидролиза казеиногена и желатины пепсином

гидролиза отрицательные объемные эффекты д л я казеиногена и

дерштрему - Лангу объяснить разнообразные эффекты, характе ­ ризующие протеолиз белков. Основываясь на многих данных, он предложил считать, что при расщеплении пептидных связей в белках электрострикцин не должна превышать

Эта величина включает в себя т а к ж е небольшое дополнителное сокращение ( ~ —3 см3 /моль) за счет возможной добавочной электрострикцин, вызываемой боковыми заряженными группами аминокислотных остатков после расщепления молекулы белка.

Существенное различие в величинах объемных эффектов было обнаружено при сравнительном исследовании белков, сильно

52

р и с. 25. Взаимосвязь между процессами уменьшения объема н увеличения аминного азота при протеоліізе казеиногена и желатины трипсином [145]

j — 4—то же, что на рис. 24

Р и с . 2в. Взаимосвязь между процессами уменьшения объема н увеличения амііпного азота при протеолнзе назе"ногсна п телатины пененном [140]

1 — 2.84%-ныіі казеиноген; 2 — 1.46%-ный

к^зеиногснГзА"^'з'''?Г?іая желатина; 4 — « %-ная желатина

/ООО

Р и с . 27. Уменьшение объема при протео­ лнзе трипсином ß-лактоглобу.иша н илупсина [143, 147]

Число расщепленных связей.

характеризуется отрицательным объемным эффектом, лежащим в пределах 15—20 см3 /моль. Согласно результатам, полученным при расщеплении пептидов, величины этих эффектов легко могут быть, объяснены электрострикцнонным эффектом, сопровождающим раз ­ рыв пептидных связей. Т а к и м образом, объемные эффекты, обус­ ловленные иными причинами, дл я ьлупеина составляют не­ более 2—3 см3 /моль.

В то ж е время уменьшение объема, сопровождающее расщеп ­ ление пептидных связей в более высокомолекулярном и обладаю­

В связи с тем, что дополнительное сокращение в сильной сте­ пени связано с начальными стадиями протеолиза, Линдерштрем - Ланг особенно подчеркивал важность «обнаженных» и, таким об­ разом, доступных в первые моменты протеолиза для фермента пеп­ тидных связей субстрата, после разрыва которых доступными ста­ новятся и остальные.

К а к следует из результатов, полученных при 40° С, общее из ­ менение объема ß-лактоглобулина при исчерпывающем расщеп­ лении трипсином равно —1400 см3 /моль белка, а полное число расщепляемых пептидных связей составляет 35. Тогда объемный і эффект, обусловленный появлением электрострикции за счет об­ разования ионных аминных и карбоксильных пар, согласно у р а в ­ нению (30), должен быть равен 35•(—20) = —700 см3 /моль. Ка ­ ким ж е образом объяснить то, что наблюдаемая величина на 700 см3 /моль больше?

Частично это дополнительное изменение объема пытались объяснить разрушением вторичной структуры белка [147, 148], как необходимой предпосылкой для расщепления той части пептид­ ных связей, которая недоступна ферменту при структурной ор­ ганизации субстрата в нативном состоянии. Действительно, было показано, что при денатурации яичного альбумина 6—8 M моче­ виной при 30° С происходит уменьшение объема на 300—

54

V

О Б Ъ Е М Н Ы Е Э Ф Ф Е К Т Ы , С О П Р О В О Ж Д А Ю Щ И Е К О Н Ф О Р М А Ц И О І Ш Ы Е

П Е Р Е Х О Д Ы В Б Е Л К А Х

НАБУХАНИЕ И РАСТВОРЕНИЕ

Прежде чем обратиться к рассмотрению конформационных пере ­

ние белка есть процесс наибольшего пасыщения межмолекуляр ­ ными взаимодействиями его полярных групп с диполями воды. Сле­ довательно, дилатометрические исследования растворения белков могут привести к обнаружению значительных объемных эффек­ тов, вызванных электрострикцпей воды.

Ввиду необычайной простоты выполнения, эксперименты по исследованию изменения объема при намачивании различных ве­ ществ ведутся у ж е с начала X I X века [154—161]. И в первых ж е работах было замечено, что при этом наблюдается уменьшение объема системы и выделяется тепло.

Исследование процессов набухания и растворения сыграло большую роль при изучении гидратации белков. Д л я этой цели с помощью капиллярного дилатометра изучали кинетику погло­

Е щ е в 1870 г. К в и и к [159] использовал дилатометрию д л я по­ лучения количественных сведений об изменении объема при на­ бухании в воде сваренного белка куриного яйца . Найденные им. величины уменьшения объема (—1,3—5,2 • 10~2 см3 /г) очень близ­ к и к значениям объемных эффектов, полученных позднее у ж е с помощью более совершенной экспериментальной техники.

Наибольшее число работ в области дилатометрии набухания было проведепо на желатине. С изучением свойств этого белка связано т а к ж е создание многочисленных разновидностей изме­ рителей объемных эффектов.

системы при переносе сухих желатиновых пластинок из керосина в воду. Им был обнаружен отрицательный объемный эффект, составлявший — 5 , 4 - Ю - 2 см/г при 35° С. Б ы л о показано, что

56

величина объемного эффекта зависит от содержания воды в жела ­ тине. П р и предварительном насыщении желатины водой до 0,4 г воды на 1 г белка объемный эффект уменьшается до—2,1 • 10~2 см3 /г. Добавление в систему сильных кислот и оснований тоже приводи­ л о к уменьшению величины объемного эффекта, однако слабые кислоты, нейтральные соли и неэлектролиты на величину объем­

ного объемного эффекта, характеризующего процесс, имеет макси­

после введения желатины в контакт с водой. Все последующие измерения объемных эффектов проводили в течение этого времени. На рис. 30 приведена также зависимость от времени отношения величины объемного эффекта к количеству впитанной белком во­ ды. Х а р а к т е р этой зависимости указывает на то, что величина объемного эффекта пропорциональна количеству поглощенной

положному тому, какой был известен ранее (рис. 29). Кривые на

О степени гидратации белков и о величинах электрострикции можно судить т а к ж е по разнице в величинах удельного объема сухого белка и кажущегося объема белка, находящегося в - р а с ­ творе.

Объемный эффект при полном растворении белка, по-видимо­ му, впервые достаточно корректно был исследован в 1913 г. Ч и - ком и Мартином [175]. Удельные объемы сухих препаратов казеи­ ногена, яичного альбумина, сывороточного альбумина и сыворо-

57

Р и с. 29. Зависимость отрицательного объемного аффекта при набухаіпш же­ латины от величины pH [во]

1 — изменение объема, отнесенное к і г Оухой желатины; 2 — изменение объе­ ма, отпесеиное к 1 г впитанной воды

Время, часы

58

воляют считать, что растворение различных белков приводит к уменьшению объема на величину того же порядка, что и при набу­ хании.

Уменьшение объема, наблюдающееся при набухании и раство­ рении белков, по-видимому, в с и л ь н о й степени зависит от взаимо­ действия групп боковых радикалов аминокислотных остатков с молекулами воды. Однако если провести оцеику величины объем­

личина объемного эффекта, обусловленного этой причиной, для многих белков приблизительно вдвое меньше, чем наблюдают при набухании и растворении [21], несмотря на то, что по этой оценке все полярные группы должны находиться на поверхности взаимо­ действия с водой. Этот результат свидетельствует о том, что объем­ ный эффект набухания и растворения может зависеть еще п от заполнения молекулами воды свободного пространства, имевше­ гося в сухом препарате. В случае белков, образующих в сухом состоянии кристаллы, часть объемного эффекта, наблюдаемого при набухании и растворении, может быть связана с характером упа­ ковки молекул белка, имевшей место в кристаллической решетке.

ПЕРЕХОД КЛУБОК-СПИРАЛЬ В ИСКУССТВЕННЫХ ПОЛИПЕПТИДАХ

Хорошо известно, что полипептидные цепи белков бывают в зна­ чительной степени спирализованы. При этом степень спирализации существенным образом зависит от условий, в которых находит­ ся белок [3, 21, 151]. Различные физнко-хнмические реакции могут приводить к повышению или понижению числа аминокислот­ ных остатков, включенных в спираль . П р и этом большинство бел­ ков не может быть спнрализованиыми полностью.

В то ж е время различные синтетические полипептиды, состоя­ щие из одного вида аминокислотных остатков, способны образовы­ вать стопроцентные спиральные структуры. Эти полиаминокис­ лоты представляют собой удобную модель для изучения спираль - ностн белков.

переходы могут сопровождаться также перераспределением внутри­ молекулярных взаимодействий между боковыми радикалами амино­ кислотных остатков. Выявлению эффекта, обусловленного только изменением процента спиральиости в белке, может способствовать

59