книги из ГПНТБ / Замятнин, А. А. Дилатометрия растворов белков

бежать ошибок, вызванных тепловыми помехами, изменения тем­ пературы системы объемом 10 см 3 не д о л ж н ы выходить за пределы + 0,005° С при чувствительности дилатомера ~ 10 5 см 3 . Следует отметить, что при проведении неизотермических измерений необ­ ходимо вводить поправку на расширение самого дилатометра. Чтобы избежать этого, можно использовать сразу два одинаковых дилатометра: один, содержащий исследуемый раствор, а другой — контрольный, содержащий только растворитель, т. е. измереипя производить по дифференциальной схеме.

При рассмотренной нами чувствительности 10~5 см 3 эта величина пренебрежимо мала. Однако при использовании дилатометров с более высокой чувствительностью (10 _ 6 см 3 ) и при длительных из­ мерениях изменение величины атмосферного давления может вно­ сить свой вклад в получаемый результат, что необходимо учиты­ вать прп его обработке.

Источником ошибок в дилатометрии может служить также при­ сутствие пузырьков воздуха в исследуемом растворе [56]. Вслед­ ствие этого растворы непосредственно перед введением в дилато­ метр (или в самом дилатометре) необходимо подвергнуть обезгаживаиию . В этой процедуре удобно использовать роторный испа­ ритель с ловушкой. Кроме того, для предотвращения вспенивания и таким образом для сохранения нативного белка лучше произво ­ дить обезгаживание не белкового раствора, а только растворителя (до растворения в нем белка).

Н а результаты измерений может также оказывать влияние степень чистоты внутренней поверхности дилатометра, в особен­ ности, к а п и л л я р а . Промывку можно производить последовательно спиртовым раствором едкого к а л и , хромовой смесью, водой, спир­ том п эфиром [57]. Разумеется, что следует принимать во внима­

32

и, используя значения длины столбика и плотности ртути, рассчи­

ления соответствующего измерителя (обычно катетометра пли отсчетного микроскопа) составляет 0,1—1 мм.

Величина измеряемого изменения объема зависит от величины объемного эффекта, характеризующего исследуемую физико-хи­ мическую реакцию данного белка, от концентраций исследуе­ мого белка и других компонентов раствора, а т а к ж е от величины объема кюветы дилатометра. Величины различных объемных эф­ фектов, которые характеризуют белковые растворы, будут нами рассмотрены в последующих разделах. Отметим только, что де­ тальное исследование этих эффектов обычно требует использова­ ния кюветы дилатометра объемом 10—100 см 3 и концентрации бел­ ка 1—50 мг/мл.

Существует т а к ж е еще целый ряд требований, которые необ­ ходимо предъявлять к определенным операциям при дилатометри­

щую из сосуда, предназначенного для заполнения исследуемой жидкостью, и к а п и л л я р а , выполняющего роль измерительного

которых случаях эта же трубка может с л у ж и т ь в качестве залив ­ ной.

Изображенные на рис. 12, 13 различные типы дилатометров обладают рядом общих недостатков. Один из них заключается в том, что из-за капиллярных явлений с помощью этих дилатомет­ ров невозможно производить прецизионные измерения в достаточ­ но концентрированных растворах белка, которые могут обладать значительной вязкостью. Кроме того, если в процессе какой-либо физико-химической реакции вязкость раствора изменяется, что бывает, например, при переходе глобула-фибрилла, то происхо­ дящее при этом изменение капиллярных свойств также скажется на искомом результате. Исследование же золь-гель перехода с помощью дилатометров такого типа совсем невозможно, поскольку образующийся гель закупоривает к а п и л л я р и не может свободно перемещаться по его каналу .

Простейшие типы к а п и л л я р н ы х дилатометров в ряде случаев

заливали его растворителем. При такой постановке опыта в ка­ пилляре постоянно находился растворитель, обладающий неиз­ менными свойствами. Однако необходимость длительного термо-

34

статнрования после введения в контакт белка и растворителя не позволяла производить измерения в начальные этапы набуха ­ ния белка. Поэтому в результате этих измерений сведения об абсолютной величине объемного эффекта, характеризующего на­ бухание, можно было получить только в некотором приближении, зависящем от способа экстраполяции кинетической кривой к мо­

исследования белковых растворов крайне нежелательно, посколь­

ническое вещество (бензол, толуол, бромбензол, керосин и т. д.), которое легче воды и водных растворов белка и поэтому распо­ лагается над исследуемым раствором.

Н а рис. 14 схематически изображены два типа ртутных дила­ тометров, один из которых (рис. 14, а) не имеет специальной от­ водной трубки [65, 66], и его можно сравнить с дилатометром, изображенным на рис. 12, б. Конструкцию же другого дилатомет­ ра (рис. 14, б) [67, 68] можно сравнить с конструкцией, изображен ­ ной на рис. 13, которую характеризует наличие специальной от­ водной трубки, значительно упрощающей процедуру герметиза­ ции дилатометра.

бенностью является наличие специального расширения 2 в ка ­

Применение специальной к а п и л л я р н о й жидкости позволило сконструировать дилатометры, в которых можно изучать набуха ­ ние белка прямо с момента введения его в контакт с растворите-

лем. Н а р п с . 16 схематически изображена конструкция дгілатометра Сведберга [72], предназначенного для этой цели. Этот ди­

дится до соприкосновения с растворителем, а, с другой стороны, выполняет функции к а п и л л я р н о й жидкости. Б е л о к в этом случае помещают на специальный держатель 4, иа котором оы находится

до достижения системой температурного равновесия. После этого с помощью платиновой проволоки 5 держатель 4 вместе с белком

дилатометров, функции к а п и л л я р н о й жидкости выполняет сам растворитель, а ртуть служит только средой, в которой содержит­ ся сухой белок до введения его в контакт с растворителем. Под­ готовку дилатометра к измерениям производят следующим обра­ зом. Сначала его сосуд заполняют ртутью, иа поверхность которой помещают сухой белок. После этого белок покрывают приспо­ соблением 2, которое утапливает его в ртуть . Затем заливают растворитель и з а к р ы в а ю т дилатометр. После достижения всей системой температурного равновесия дилатометр осторожно на­ клоняют, в результате чего сухой белок всплывает на поверхность ртути и таким образом входит в контакт с растворителем. В этом

36

Р и с . 15. Дилатометр, снабженным ловушкой для раствора, проникнувшего в капилляр, с ртутью в качестве капиллярной жидкости [G9—71]

1 — сосуд дилатометра; г — ловушка; 3 — капилляр

Р и с . 10. Дилатометр Сведбсрга для наследования набухания белка с керосином в ка­ честве капнллярпоіі жидкости [721

Р и с ' . 17. Дилатометр для исследования набухания белка с растворителем в качестве капиллярной жидкости и с ртутью в качестве среды для белка до введения его в контакт с растворителем [73]

1 — сосуд дилатометра; 2 — приспособление для погружения сухого белка в ртуть; 3 — пробка; 4 — капилляр

случае измерения т а к ж е можно вевти с момента начала процесса набухания белка.

Несмотря на то, что применение описанных дилатометров поз­ волило избежать использования растворов белка в качестве ка­ пиллярной жидкости, такие дилатометры пригодны д л я иссле­ дования в основном только однокомпонентных систем. Это обстоя­ тельство существенно сужает область их применения. Необходи-

37

мость проведения исследований физико-химических реакций в растворах белков при введении их в контакт с другими раство ­ ренными веществами потребовала поисков новых конструкций, способных удовлетворить этому требованию.

ДИЛАТОМЕТР СРИИИВАЗАЙИ И СРИРАНГАХАРА [57, Ü3]

Дилатометр для исследования двухкомпонентных систем впервые

ходимо было производить вне сосуда дилатометра задолго до начала измерений.

Прибор Сринпвазаші н Срирангахара представляет собой тип

времени постоянную температуру. После достижения системой температурного равновесия компоненты I vs. I I смешивают осто­

применяющегося в настоящее время дилатометра несколько от­

метром особое внимание было уделено подбору к а п и л л я р н о й ж и д -

38

M

мом-Лангом [74—70], в котором капилляр совмещен с пробкой, закрывающей дилатометр Обозначения те же, что на рис. 18

кости. Если вначале для этого использовались смеси керосина с бромбеизолом [74—76], то в дальнейшем [77—81] в основном при­ меняют особо очищенный керосин. В специальных случаях для этой цели можно использовать ртуть [82].

Проблема надежной герметизации прибора также была пред­ метом специального исследования [83]. В результате предложен специальный состав смазки, которой покрывают шлифованные стеклянные поверхности горла и пробки дилатометра.

С помощью двухпузырькового дилатометра произведено ис­ следование большого числа самых разнообразных реакций, которые позволили получить новые представления о кинетике объемных эффектов. Однако непрерывное повышение требований к чувстви­ тельности и точности дилатометрических измерений при все более глубоком подходе к исследованию белков приводит к необхо­ димости отметить два существенных недостатка, которыми обла­ дают такие дилатометры.

Первый из них состоит в том, что смешивание компонентов не­ обходимо производить покачиванием дилатометра в ультратермо­ стате. Эта процедура, во-первых, не гарантирует быстрое и пол-

39