Лабор.діагност.вірус.хв

доступні для будь-якої вірусологічної лабораторії. Разом з тим, не можна повністю гарантувати стерильність цієї живої системи, оскільки курячі ембріони від зараженої птиці можуть містити різні патогенні агенти (віруси лейкозу, саркоми Рауса, ньюкаслської хвороби, грипу, парагрипу-2, інфекційного бронхіту, інфекційного ларинготрахеїту, енцефаломієліту, віспи, аденовіруси, мікоплазми, сальмонели).

Для зараження використовують курячі ембріони віком від5 до 12 діб із благополучних щодо інфекційних захворювань господарств. Ембріони старшого віку менш чутливі до вірусів, що пов'язано з підвищенням у них концентрації неспецифічних вірусних інгібіторів.

Будову курячого ембріонанаведено на рис. . Зовні ембріон вкритий твердою пористою шкаралупою, до якої прилягає підшкара-

дихання ембріона. ХАО обмежує алантоїсну порожнину, в якій нагромаджуються продукти обміну

(сечокислі солі, фосфорні й азотисті сполуки). Зародок знаходиться в яйці ексцентрично, спиною ближче до шкаралупи, голова спрямована в бік повітряної камери. Він лежить вам-ніотичній порожнині, що заповнена навколоплідною рідиною та оточена оболонкою. Зародок

пуповиною зв'язаний ізжовтковим мішком, що є резервуаром поживних речовин. У гострому кінці яйця знаходиться залишок білка, який містить лізоцим, що захищає зародок від стафілококової та інших інфекцій.

Залежно від тропізму віруси можуть репродукуватися в клітинах тіла зародка, амніона, ХАО і жовткового мішка, де нагромаджуються в найбільшій концентрації. Водночас багато вірусів здатні накопичуватися в алантоїсній та амніотичній рідинах. Зараження в ту чи іншу

структуру курячого ембріона проводять у період її максимального розвитку, коли кількість клітин є найбільшою. У процесі розвитку

У лабораторії курячі ембріони інкубують у термостаті за температури +37 °С, вологості 60 - 70 % і відкритих вентиляційних отворах.

Перед зараженням курячі ембріони розглядають на овоскопі в темному приміщенні. При цьому встановлюють їхню життєздатність:

судини ХАО наповнені кров, 'юзародок рухомий. На шкаралупі простим олівцем відмічають межу повітряної камери -і місце знаходження зародка. Шкаралупу перед зараженням обробляють2%- м спиртовим розчином йоду, а іноді ще й протирають запаленим спиртовим тампоном.

Методи експериментального зараження курячих ембріонів.

Розроблено шість методів експериментального зараження курячих ембріонів:

1)в алантоїсну порожнину (9 - 11-й день інкубації); 2)на ХАО (10 - 12-й день інкубації); 3)у жовтковий мішок (5 — 7-й день інкубації);

4)в амніотичну порожнину (6 - 10-й день інкубації); 5)у тіло зародка (7 - 12-й день інкубації); 6)у судини ХАО (11 - 12-й день інкубації).

Останні два методи використовуються нечасто. Інокуляція інфекційного матеріалу в тіло зародка часто супроводжується

ХАО, зрізають ножицями і вміщують у чашку Петрі з0,9%-м розчином КаСІ. Виймають зародок, підтримуючи його за шию та відділяючи від пупкового канатика. Жовтковий мішок і білок вносять у чашку Петрі. Частину ХАО, що залишилася на шкаралупі, виймають пінцетом, вміщують у чашку Петрі 0,9%з -м розчином КаСІ, промивають до одержання прозорої рідини, розправляють двома пінцетами і розглядають на темному фоні. Двома пінцетами беруть жовтковий мішок, витискають його вміст, переносять у чашку Петрі з 0,9%-м розчином КаСІ і промивають.

Вірусовмісний матеріал, одержаний при розтині курячих ембріонів, перевіряють на стерильність(посіви на МПА, МПБ, МППБ, середовище Сабуро) і використовують для ідентифікації виділеного збудника. Зберігають матеріал при —20...—70 °С.

Ознаками розмноження вірусів у курячих ембріонах є загибель

(у характерні для кожного виду вірусу строки), патологоанатомічні зміни і гемаглютинація з ембріональними рідинами. З патологоанатомічних змін найтиповішими є помутніння і набряк ХАО, утворення на ХАО некротичних вузликів— віспин , осередків клітинної проліферації — пустул, чи бляшок, гіперемія, крововиливи і набряки на тілі зарод, карликовість і муміфікація зародка, осередки некрозу в паренхіматозних органах, зміна кольору печінки.

віспи курей (а), віспи корів (б) і хвороби Ауескі

Важливим методом індикації вірусів у курячих ембріонах єреакція гемаглютинації (РГА), що грунтується на здатності вірусів

склеювати еритроцити певного виду. Ця властивість зумовлена наявністю у вірусів білка гемаглютиніну, за рахунок якого вони адсорбуються на поверхні еритроцитів. Один віріон приєднується

індикації в курячих ембріонах гемаглютинувальних вірусів(грипу ссавців і птахів, ньюкаслської хвороби, інфекційного бронхіту птиці, параг-рипу-3 ВРХ, чуми м'ясоїдних та ін.). Особливо цінна ця реакція при виявленні вірусів, які розмножуються в курячих ембріонах спричинюють жодних змін(наприклад, віруси грипу коней, параг- рипу-3 ВРХ, слабовірулентні штами вірусу ньюкаслської хвороби). Для постановки РГА на склі змішують краплю ембріональної рідини (алантоїсної або амніотичної) з краплею 5%-ї суспензії еритроцитів певного виду. За наявності гемаглютинувального вірусу через5 — 10 хв випадають пластівці склеєних еритроцитів.

ВИДІЛЕННЯ ВІРУСІВ У КУЛЬТУРАХ КЛІТИН

Найдосконалішою моделлю для виділення вірусів із патологічного матеріалу є культура клітин. Вона знімає видові обмеження культивування вірусів, оскільки іп уііго можна вирощувати будь-які клітини різних видів тварин. Немає єдиної клітинної культури, яка була б придатною для виділення будь-якого вірусу. Тому в лабораторній діагностиці зазвичай застосовують кілька видів культурза лежно від того, який вірус передбачається виділити.

У вірусологічній практиці найчастіше використовують одноша-

рову (моношарову) культуру клітин. Це клітини іп угЬго, одержані в результаті диспергування тканин, які прикріплюються до субстрату і розмножуються, утворюючи моношар (на склі пробірок, флаконів, матраців). Одношарові культури клітин поділяються напервинні,

субкультури, перещеплювані й диплоїдні.

Первинні (або первинно-трипсинізовані) культури клітин

одержують з органів і тканин, що взяті безпосередньо з організму. Для отримання первинної культури клітин можна використовувати різноманітні тканини, як ембріонів, так і дорослих тварин. Вибір клітин для культивування визначається їхньою чутливістю до того чи іншого вірусу. Прямої залежності між сприйнятливістю тварин іп

природно сприйнятливої до певного вірусу. Краще культивуються іп УІЇГО клітини ембріональних тканин, а також тварин раннього віку, оскільки вони мають вищу потенцію росту.

Для отримання первинної культури клітин від здорової тварини не пізніше 2—3 год після забою беруть відповідні органи або тканини, наприклад, нирки, сім'яники, легені, шкіру. Подрібнюють ножицями на шматочки розміром 2 — 5 мм, промивають кілька разів розчином

Хенкса до одержання прозорої рідини й обробляють протеолітичним ферментом, найчастіше 0,25%-м розчином трипсину, для дезагрегації тканини. Трипсинізацію проводять на магнітній мішалці дробно за температури +37 °С 3 — 5 разів по 5 — 30 хв (залежно від виду тканини до повного її виснаження) або за +4...+6 °С 12 — 16 год. Фермент руйнує міжклітинні речовини, і тканина диспергується на окремі клітини. Трипсин із клітинами, що відділили-ся, зливають у центрифужні пробірки, дію ферменту при методі теплої трипсинізації припиняють охолодженням або додаванням2 - 4 % сироватки крові ВРХ і центрифугують при1000 об/хв 10 - 15 хв. Трипсин видаляють,

фільтрують через 2-3 шари марлі. Після підрахунку кількості клітин у камері Горяєва* суспензію розводять ростовим середовищем до оптимальної посівної концентрації(200 - 500 тис. клітин у 1 см3), розливають по пробірках(по 1 см3) або матрацах (10 - 15 % від об'єму), вміщують у термостат при +37 °С.

У своєму розвитку культура клітин проходить три фази. Перша фаза — адаптації, триває 2-24 год і характеризується адгезією клітин, тобто прикріпленням їх до скла. Друга фаза — логарифмічного росту, супроводжується поділом клітин, які поступово покривають поверхню скла. Третя фаза — стаціонарна, характеризується формуванням через 3-5 діб моношару внаслідок контактної інгі-біції клітин, тобто припинення їхнього поділу при контакті(рис. 78, 79). Швидкість утворення моношару на склі залежить від виду тканини, віку тварини, якості живильного середовища, посівної концентрації клітин та інших факторів. Після сформування моношару ростове середовище змінюють на підтримувальне (без сироватки

. Первинні культури клітин сім'яників теляти (а) і легень ембріона вівці (б)

Моношар зберігає життєздатність упродовж 1-3 тижнів (при періодичній зміні середовища, яке забруднюється продуктами

метаболізму клітин). З часом клітини старіють, і настає їхнянеспецифічна дегенерація: вони округлюються, відриваються від скла і гинуть.

Первинні культури не мають багатьох клітин, які присутні у вихідній тканині, оскільки не всі клітини здатні прикріпитися до субстрату і вижити в умовах іп УІЇГО. Однак клітини первинних культур

гетерогенні, й у них найповніше представлені типи клітин тієї тканини, звідки вони одержані. Первинні культури високочутливі до вірусів, онкогенно безпечні. Недоліком їх є значна трудомісткість одержання, а також можливість контамінації латентними вірусами і мікоплазмами, що персистують в організмі тварин, тканини яких використовують для трипсинізації.

Первинна культура . Субкультура фібробластів

Субкультури (або вторинні культури клітин) одержують із первинних, вирощених у матрацах, після формування моношару. Клітини знімають зі скла0,25%-м розчином трипсину або0,02%-м розчином версену (експозиція 15 - ЗО хв при +37 °С до появи перших ознак відшарування клітин), ресуспендують у ростовому живильному середовищі до посівної концентрації й пересівають у матраци або пробірки. Через 2-3 доби формується моношар вторинної культури клітин (рис. 80).

За чутливістю до вірусів субкультури не відрізняються від первинних. Проте при субкультивуванні кількість клітин збільшується у 2

— 2,5 рази. Крім того, з'являється можливість виявити контамінацію клітин вірусами і мікоплазмами, також отримати одноріднішу популяцію клітин. Субкультури можна одержати при2-5 пересівах, зрідка — до 8 - 10. Наступні пасажі призводять до зміни морфології клітин та їхньої загибелі. Якщо клітинні культури пройшли понад10 пасажів, вони перебувають на стадії переходу до диплоїдних або перещеплюваних.

Перещеплювані культури клітин(син.: стабільні, або по-

стійні, клітинні лінії) одержують із первинних шляхом тривалих

пересівів (не менш як70 разів із триденними інтервалами) Такі клітини, як правило, мають змінений каріотип порівняно з вихідною культурою (гетероплоїдний набір хромосом), необмежений строк життя, і багато з них виявляють онкогенні властивості

Одержання перещеплюваних культур клітин — досить рідкісне явище. Перещеплювані клітинні лінії вдається отримати з популяції клітин первинних культур, які мають підвищену активність росту і розмноження. Відносно причин появи перещеплюваних клітин існують різні точки зору. Зокрема, вважають, що такі клітини з'являються в результаті мутацій або активізації клітинних онкогенів

Перещеплювані культури клітин можна одержати як із нормальних, так і пухлинних тканин тварин і людини. Серед них широко застосовуються такі клітинні лінії, як НеLа (з карциноми шийки матки жінки), Нер-2 (з карциноми гортані людини), СНЕВ, ВНК та ін. Нині існують соті різновидів перещеплюваних клітинних культур. Практично для кожного з відомих вірусів хребетних можна підібрати

чутливу з них. Для цього слідзвернутись до відповідних банків клітинних культур. Перещеплювані КК досить зручні, проте інколи втрачають вихідні властивості, включаючи чутливість до вірусу, та набувають ознак злоякісного переродження(малігнізація). Окрім первинних та перещеплюваних використовують такоє диплоїдні КК – культури з належним хромосомним апаратом.

Диплоїдні культури клітин (син.: диплоїдні клітинні лінії) —

це морфологічно однорідні популяції клітин, стабілізовані в процесі культивування іп УІІГО, які мають обмежений строк , життя характеризуються трьома фазами росту, зберігають каріотип, властивий вихідній тканині, вільні від контамінантів і не виявляють онкогенної активності при трансплантації хом'ячкам.

Диплоїдні культури клітин отримані з різних тканин ембріона людини (легені, нирки, серце, шкірно-м'язова тканина та ін.) і тварин (нирки ембріонів корів, овець, свиней; нирки телят, ягнят, поросят; шкіра, тимус, селезінка, кістковий мозок і лімфатичні вузли кролів і морських свинок та .)ін. Одержання диплоїдної культури клітин

проходить у три етапи: 1) виготовлення посівного пулу клітин і заморожування його основної частини; 2) контроль диплоїдності; 3) нагромадження диплоїдних клітин безпосередньо для розмноження вірусів. Строк життя диплоїдної культури клітин обмежений— 40 - 60 пасажів. Далі поступово настає дегенерація клітин.

Диплоїдні культури мають переваги порівняно з первинними й перещеплюваними. Вони стерильні щодо вірусних контамінантів і мікоплазм, позбавлені онкогенної активності, здатні роками збері-

перещеплюваної). Цей метод застосовують при вивченні хронічних і повільних вірусних інфекцій.

При латентних інфекціях нечасто вдається виділити вірус традиційним шляхом зараження клітинних культур суспензією з

носового, трахеального і бронхіального епітелію. При цьому шматочки тканини розміром1-3 мм вміщують у чашку Петрі, вносять живильне середовище (агар, зсіла плазма або синтетичне) в такій кількості, щоб фрагменти тканини знаходилися на його поверхні. Поживні речовини проникають в експлантат шляхом дифузії. Це

створює умови для збереження органоспецифічної диференціаці експлантата при відсутності або помірному розростанні його тканин.

При цьому зберігається не тільки структура тканини, й деякі

втратили властивість контактної інгібіції й набули здатності до безперервного поділу .Індикацію вірусів у культурі клітин можна провести за явищем гемадсорбції. Це прикріплення еритроцитів до поверхні клітин, заражених гемаглютивальним вірусом(наприклад, грипу ссавців і птахів, парагрипу-3 ВРХ, ньюкаслської хвороби).

спорідненою з рецепторами еритроцитів. Кожний вірус здатиніі спричинити гемадсорбцію еритроцитів того , видуякий він аглютинує, причому гемадсорбція виявляється швидше, ніж ЦПД.

Для постановки реакції гемадсорбції (РГАд) у 2 —4 пробірки з ін-фіконапого культурою клітин через3 — 5 діб після зараження вносять по 0,2 см;і 0,4 —0,5%-ї суспензії еритроцитів певного виду. Пробірки витримують у горизонтальному положенні10—15 хв за кімнатної температури або ЗО40 хв при +4 °С (залежно від виду вірусу), злегка струшують і розглядають під малим збільшенням

інгібувати утворення бляшок. Інкубацію проводять клітинами догори. Спостерігають за появою бляшок упродовж 4-12 діб.

За цей час адсорбований вірус проникає всередину клітин, проходить повний цикл репродукції. Віріони потомства можуть уражати