Лабор.діагност.вірус.хв
..pdfвирізають |
шматочки |
масою10 |
— |
20 |
г, |
захоплюючи |
також |
|
|
|||||||
неушкоджену тканину. Головний мозок беруть повністю, розпилюючи |
|
|
||||||||||||||
черепну коробку після видалення волосяного покриву, шкіри і м'язів |
|
|
||||||||||||||
та зняття твердої мозкової оболонки. Спинний мозок виймають цілим |
|
|
||||||||||||||
або фрагментами разом із корінцями, розсікаючи вздовж хребта м'язи |
|
|
||||||||||||||
спини, |
остисті |
відростки |
хребців |
і |
видаливши |
тверду |
мозкову |
|||||||||
оболонку. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Консервування і транспортування проб патологічного мате- |
|
|
||||||||||||||
ріалу. Взятий патологічний матеріал потрібно якнайшвидше закон- |
|
|
||||||||||||||
сервувати, щоб зберегти вірус, оскільки його титр за відсутності жи- |
|
|
||||||||||||||
вих клітин швидко знижується. Найкращим методом консервування |
|
|
||||||||||||||
патологічного матеріалу є використання термосів з охолоджувальни- |
|
|
||||||||||||||
ми сумішами: 1) три частини льоду та одна частина кухонної солі(- |
|
|
||||||||||||||
15...-20°С); 2) суміш однакових об'ємів сухого льоду(твердої вугле- |
|
|
||||||||||||||
кислоти) й етилового спирту (-70 °С); 3) сухий лід (-79 °С). |
|
|
|
|
||||||||||||
Треба мати на увазі, що деякі віруси швидко гинуть при заморо- |
|
|
||||||||||||||
жуванні. Це стосується насамперед респіраторних вірусів (наприклад, |
|
|
||||||||||||||
віруси ПГ-3 і РС ВРХ). Тому для збереження таких збудників |
|
|
||||||||||||||
патологічний матеріал консервують за темпер атурт танучого льоду |
|
|
||||||||||||||
(+2...+4 °С). У деяких випадках вірусовмісний матеріал зберігають у |
|
|
||||||||||||||
рідкому азоті (-196 °С), зокрема кров і пухлинну тканину при діаг- |
|
|
||||||||||||||
ностиці хвороби Марека. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Для |
консервування |
шматочків |
органів |
|
|
і |
тканин |
можна |
||||||||
використовувати 50%-й розчин гліцерину (на 0,9%-му розчині МаСІ) |
|
|
||||||||||||||
у співвідношенні 1: 5 ... 1: 10. Однак треба мати на увазі, що такий |
|
|
||||||||||||||
патологічний матеріал не придатний для дослідження в РІФ. Тому |
|
|
||||||||||||||
одночасно з пробами матеріалу, вміщеними у флакони з гліцерином, |
|
|
||||||||||||||
потрібно направляти мазки-відбитки на предметних стеклах для |
||||||||||||||||
люмінесцентної мікроскопії. Гліцерин не підходить для вірусовмісних |
|
|
||||||||||||||
рідин, |
особливо |
тоді, коли |
потрібно |
|
заражати |
живі |
об'єкти |
|||||||||
(лабораторні тварини, курячі ембріони чи культури клітин). Окрім |
|
|
||||||||||||||
глгцерину, |
шматочки |
органів |
і |
тканин |
можна |
вмішувати |
в |
|||||||||
стабілізувальне середовище. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
На пробірки і флакони наклеюють етикетки з лейкопластиру, де |
|
|
||||||||||||||
пишуть |
|
простим |
олівцем, який |
саме |
|
матеріал |
і |
від |
|
якої |
||||||
твариниодержаний. Проби вміщують у металевий контейнер, який |
|
|
||||||||||||||
кладуть у термос і обкладають |
мішечками |
|
з |
охолоджувальною |
||||||||||||
сумішшю. Проби, консервовані |
гліцерином |
або |
|
стабілізувальним |
|
|
||||||||||
середовищем, надсилають незамороженими за температури танучого |
|
|
||||||||||||||
льоду (+2...+4 °С). На |
термос із пробами |
патологічного |
матеріалу |
|
|
|||||||||||
прикріплюють бирку |
з |
картону |
або |
|
фанери, на |
якій |
вказують |
|
|
|||||||
господарство, вид тварини, вид матеріалу і дату. Термос має бути |
|
|||
опечатаним. На матеріал, що надсилають |
до лабораторії, пишуть |
|
||
супровідну, де подають повну інформацію про тварину, від якої взято |
|
|||
проби, епізоотологічні дані господарства, вид матеріалу, попередній |
|
|||
діагноз, прізвище спеціаліста і дату. Цими даними керуються при |
|
|||
виборі напряму лабораторного дослідження. |
|
|
|
|
Доставлені в лабораторію проби треба негайно використати для |
|
|||
виділення вірусу. Якщо з якихось причин(наприклад, відсутність |
|
|||
культури клітин) дослідження відкладається, патологічний матеріал |
|
|||
потрібно зберігати |
при-20...-70 °С. Слід |
уникати багаторазового |
|
|
заморожування і відтавання його, оскільки це призводить до інак- |
|
|||
тивації вірусу. |
|
|
|
|
Підготовка вірусовмісного матеріалу для дослідження. У |
|
|||
лабораторії одержаний патологічний матеріал звільняють від -кон |
|
|||
серванту (розморожують, відмивають від гліцерину). Частину мате- |
|
|||
ріалу використовують для вірусологічного дослідження, іншу — |
|
|||
зберігають у холодильнику на випадок додаткових досліджень. |
|
|
||
Підготовка органів і тканин(одержання 10%-ї вірусовмісної |
|
|||
суспензії). Тканину ретельно подрібнюють ножицями, розтирають у |
|
|||
ступці .'і доливанням стерильного кварцового піску, розбавляють |
|
|||
фосфитпо-буфсриим |
розчином (ФБР) або |
розчином |
Хенкса |
з |
розрахунку І : 10, центрифугують при 2-3 тис. об/хв упродовж 15-:І() хи. Надосадову рідину (вірусовмісну суспензію) переносять у флакони і додають антибіотики широкого спектра дії для деконтаміііації (звільнення від супутньої мікрофлори): пеніцилін 100-1000 ОД/см3 і стрептоміцин100 -1000 мкг/см3 (дози залежать від віщу
тканини). |
Після експозиції |
ЗО60 хв за |
кімнатної |
температури |
|
|
ставлять бактеріологічний контроль: роблять посіви на МПА, МПБ, |
|
|||||
МППБ і середовище Сабуро. При негативному результаті -бак |
|
|||||
теріологічного контролю вірусовмісну суспензію використовують для |
|
|||||
зараження лабораторних об'єктів, а в разі позитивного результату її |
|
|||||
повторно |
обробляють |
антибіотиками |
і |
знову |
перевіряють |
на |
стерильність. У рідкісних випадках вірусовмісну суспензію звільняють від мікрофлори пропусканням крізь фільтри(фарфорові, азбестові, мембранні), що пов'язано з частковою адсорбцією на них вірусу. Вірусовмісну суспензію зберігають при —20...—70 °С.
Підготовка секретів і змивів. Секрети і змиви центрифугують при 2-3 тис. об/хв, надосадову рідину обробляють пеніциліном 500 - 1000 ОД/см3 та стрептоміцином 500 - 1000 мкг/см3 і після бак-
теріологічного контролю використовують для зараження лабораторних об'єктів. З осаду роблять мазки для РІФ. Аналогічно готують змиви і мазки, отримані за допомогою ватних тампонів, занурених у стабілізувальне середовище. Тампони струшують 10-15
хв, ретельно |
витискають, |
отриману |
рідину |
центрифугують, |
|
обробляють антибіотиками, ставлять бактеріологічний контроль. |
|||||
Підготовка калу. У флакон зі скляними намистинами вносять 10 |
|||||
см3 ФБР або розчину Хенкса і 1 г калових мас. Струшують до |
|||||
утворення гомогенної |
суміші, |
центрифугують при 2-3 тис. об/хв. |
|||
Надосадову |
рідину |
обробляють пеніциліном500 |
-1000 ОД/см3, |
||
стрептоміцином 500 - 1000 мкг/см3 і ністатином ЗО - 40 ОД/см3, ставлять бактеріологічний контроль. Вірусовмісну суспензію зберігають при -10...-20 °С. У день зараження лабораторних об'єктів її розморожують і повторно центрифугують.
Підготовка |
.сечі Сечу |
за |
потреби |
освітлюють |
центрифугуванням при 2-3 тис. об/хв, обробляють пеніциліном 500 - |
||||
1000 ОД/см3 і |
стрептоміцином500 |
- 1000 |
мкг/см3, ставлять |
|
бактеріологічний контроль.
Підготовка вмісту везикул і пустул. Нативні везикулярну і пу-
стульозну рідини розбавляють0,9%-м розчином ШСІ або розчином Хенкса 1 : 5, центрифугують при 2-3 тис. об/хв 20 хв, обробляють пеніциліном 200 - 500 ОД/см3 і стрептоміцином200 - 500 мкг/см3, ставлять бактеріологічний контроль. Аналогічно готують везикулярну
іпустульозну рідини, розбавлені стабілізувальним середовищем 1 : 5; освітлюють центрифугуванням, обробляють антибіотиками, ставлять бактеріологічний контроль.
Підготовка уражень шкіри і слизових оболонок. Стінки везикул
іпустул, кірки та луски шкіри розтирають у ступці зі стерильним кварцовим піском, розбавляють 0,9%-м розчином ШС1 або розчином
Хенкса 1 : 5 - 1 : 10, центрифугують при 2-3 тис. об/хв, обробляють пеніциліном 200 - 500 ОД/см3 і стрептоміцином200 - 500 мкг/см3, ставлять бактеріологічний контроль.
Підготовка крові. Кров (дефібриновану, «лакову» або з антикоагулянтом) заморожують. Після відтавання гемолізовану кров
центрифугують при 2-3 тис. об/хв 15 хв, обробляють пеніциліном 100
— 200 ОД/см3 і стрептоміцином100 - 200 мкг/см3, ставлять бактеріологічний контроль. Для виділення вірусу придатна також зсіла кров. її розтирають у ступці, додають розчин Хенкса 1 : 1 або 1 : 2,
центрифугують, обробляють |
антибіотиками, ставлять |
бактері- |
ологічний контроль. |
|
|
Одержання сироватки крові. Беруть 10-15 см3 крові в стерильну |
|
|||||||
пробірку з гумовою пробкою, витримують 1 год |
при +37 °С. Утво- |
|
||||||
рений згусток обводять скляною паличкою або пастерівською піпет- |
|
|||||||
кою та ставлять на18 - 20 год у холодильник при+4 °С (для при- |
|
|||||||
скорення |
ретракції |
кров'яного |
згустку |
і |
збільшення |
виходу |
||
сироватки). |
Сироватку |
відбирають |
піпеткою, за |
потреби |
|
|||
центрифугують |
при 1500 об/хв для |
видалення |
домішок |
еритроцитів, |
|
|||
обробляють пеніциліном 100 — 200 ОД/см3 і стрептоміцином 100 — |
|
|||||||
200 мкг/см3, |
ставлять |
бактеріологічний |
|
контроль. Зберігають |
|
|||
сироватки в холодильнику при +4 °С або в замороженому стані при —
10...—20 °С.
ЕКСПРЕС-ДІАГНОСТИКА ВІРУСНИХ ХВОРОБ
ВІРУСОСКОПІЯ
Вірусоскопію використовують для індикації в патологічному матеріалі віріонів вірусів віспи ссавців і птиці та контагіозної ектими овець і кіз із родини Рохиігісіае, розміри яких досягають (170...260) х х (300...390) нм. Мазки готують із папул, везикул, пустул або кірок, у птиці — з віспяних бородавок, висушують на повітрі й перед фарбуванням вміщують на3 хв у дистильовану воду. Для фарбування віріонів найчастіше використовують три методи: Морозова, Пашена або Герцберга. Найзручнішим і загальнодоступним є метод Морозова.
Фарбування за Морозовим,.
1.Реактив № 1 — рідина Руге (1 см3 льодової оцтової кислоти, 2 см3 формаліну і100 см3 води) — 1 хв; промивають дистильованою подою.
2.Реактив № 2 — розчин таніну (5 г таніну, 100 см3 дистильованої води і І см3 рідкої карболової кислоти) — 1—2 хв; промивають дистильованою подою.
3.Реактив №) 3 розчин аміачного срібла(5 г срібла нітрату
розчиняють у 100 см3 дистильованої води і додають по краплях 2Г)%-(і розчин аміаку, поки не розчиниться утворений буро-чорний осад і по залишиться легка опалесценція; для фарбування реактив ролҐжляють дистильованою водою 1 : 10) — 1 -2 хв при легкому пі дігріванні до появи темно-коричневого забарвлення; промивають
дистильованою водою.
Висушені на повітрі або філь |
|||||
трувальним |
|
папером |
препарати |
||
розглядають |
у |
світловому |
мікро |
||
скопі під імерсійною олією. Наяв |
|||||
ність на жовтому фоні препарату |
|||||
великої кількості дрібних темно- |
|||||
коричневих |
тілець |
округлої |
фор |
||
ми, |
які |
розміщені |
|
у |
|
вигляді |
чень, |
|
рядами |
або |
, |
дифузносвід |
|
чить |
|
про |
присутність |
- |
у |
|
Рис. 63. Віріони вірусу віспи корів, му матеріалі віріонів вірусів віспи фарбування за М.А. Морозовим або контагіозної ектими овець І
Фарбування за Пашеном.
1.Синька Льоффлера (ЗО см3 насиченого спиртового розчину метиленової синьки і100 см3 0,01%-го розчину калію гідроксиду; витримують 1 міс у термостаті при+37 °С для дозрівання) — 1 - 3 хв при підігріванні до появи пари; промивають дистильованою водою.
2.Фуксин Ціля (1 г фуксину, 10 см3 абсолютного спирту і100 см3 5%-ї карболової кислоти) — 1 — 3 хв при підігріванні до появи пари; промивають дистильованою водою.
3.Абсолютний спирт або 5%-й розчин таніну — 3 — 5 хв; промивають дистильованою водою.
Віріони поксвірусів зафарбовуються в червоно-рожевий колір, фон препарату — синій.
Фарбування за Герцбергом.
3%-й розчин Уіспзгіа Ьіаи 4К (фарбу прогрівають у водяній бані 30 хв при +60 °С, витримують 2 тижні для дозрівання) — 15 хв; промивають дистильованою водою.
Віріони поксвірусів зафарбовуються в яскраво-синій колір, фон препарату — блакитний.
Перевагою вірусоскопії є швидкість одержання результатів (упродовж 0,5 - 1 год після доставляння матеріалу в лабораторію), простота і доступність техніки виконання. Недоліком є те, що найчіткіші результати можна отримати тільки при дослідженні мазків зі свіжих везикул і везикулярної рідини(до нагноєння) або свіжих віспяних бородавок у птиці. У разі використання мазків із пустул і кірок достовірність методу значно знижується. Методом вірусоскопії не завжди вдається відрізнити віріони від подібних за формою клітинних елементів. Окрім того, вірусоскопія не дає змоги диференціювати
різні види вірусів віспи.
ЕЛЕКТРОННА ТА ІМУНОЕЛЕКТРОННА МІКРОСКОПІЯ
Електронна мікроскопія є важливим методом ідентифікації вірусів, який дає змогу диференціювати їх за морфологією. Особливе значення цього методу при дослідженні вірусів, які важко культивуються в лабораторних умовах, а також при виділенні нових збудників. Широке застосування електронної мікроскопії в діагностиці вірусних інфекцій стримується обмеженою доступністю електронних мікроскопів для лабораторій та їхнім технічним обслуговуванням.
Приготування препаратів для електронної мікроскопії.
Дослідні об'єкти для електронного мікроскопа мають бути у вигляді вірусовмісних суспензій або ультратонких зрізів, які вміщують на мідні предметні сітки, вкриті колодієвими, формваровими або ву-
глецевими плівками-підкладками.
Для одержання чіткого зображення потрібно створити різну електронну щільність між фоном і об'єктом, а також структурами об'єкта. Як контрасту вальні речовини використовують 2 — 4%-ві водні розчини фосфорно-вольфрамової кислоти, молібдату амонію,
силіційвольфрамовокислого |
натрію; 0,5 — 2%-й |
водний |
розчин |
||||
оцтовокислого уранілу (ураніл-ацетату); 0,5%-й |
|
водний |
розчин |
||||
щавеле-вокислого уранілу (ураніл-оксалату); 1%-й водний розчин |
|||||||
мураши-нокислого |
уранілу (ураніл-форміату). |
Контрастувальна |
|||||
речовина |
непроникна |
для |
електронного |
, |
пучкаякий |
легко |
|
проходить крізь органічний матеріал. Вона обволікує |
віріони, |
||||||
проникає в їхні гідрофільні ділянки, заміщуючи воду, і робить |
|||||||
віріони електронно-щільними, чітко визначаючи |
при цьому їхню |
||||||
структуру.
Для створення контрасту між дослідним об'єктом і фоном
препарату |
|
застосовують |
|
методи |
|
негативного |
і |
позитивного |
||
контрастування. |
При |
|
негативному |
|
контрастуванні |
|||||
контрастувальна речовина |
|
|
|
|
|
|
|
|||
високої |
електронної |
щільності |
|
і |
|
|
||||
оточує |
віріони, |
що |
мають |
меншу |
|
|
||||
щільність, |
і |
вони |
виглядають світлішими |
|
|
|
|
|||
на темному |
фоні |
При позитивному |
ко- |
|
|
|
|
|||
нтрастуванні, |
навпаки, |
|
віріони |
|
|
|
|
|||
виглядають темнішими на світлому фоні ( |
|
|
|
|
||||||
Підготовка |
|
|
вірусовмісного |
|
|
|||||
матеріалу |
для електронної |
|
мікроскопії |
|
|
|
||||
залежить від концентрації вірусу, його |
|
|
|
|
|
|
|
||||||
чистоти |
від |
|
сторонніх |
баластних |
|
|
|
|
|
||||
речовин і морфології. Електронна мікро- |
|
|
|
|
|
|
|
||||||
скопія дає позитивні результати, якщо |
|
|
|
|
|
|
|
||||||
вміст віріонів у 1 см3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
вірусовмісної суспензії становить не менше ніж 105 —106. |
|
|
|||||||||||
Здебільшого потрібне попереднє очищення і концентрація вірусу. |
|
|
|||||||||||
Шматочки |
органів, |
тканин |
і калові масигомогенізують |
у 9 |
|
||||||||
об'ємах дистильованої води, освітлюють центрифугуванням при 5 — |
|
||||||||||||
10 тис. об/хв 10 — 20 хв, із надосадової рідини готують препарати. |
|
||||||||||||
Для очищення і концентрації вірусу до надосадової рідини додають |
|
||||||||||||
60 % насиченого розчину амонію сульфату, ретельно струшують і |
|
||||||||||||
вміщують на 1 год у рефрижератор. Потім суміш центрифугують при |
|
||||||||||||
9 — 11 тис. об/хв 10 хв, |
надосадову рідину |
зливають, |
а |
осад |
ре- |
|
|||||||
суспендують у 2 — 4 краплях дистильованої води. З |
такої |
суспензії |
|
||||||||||
одержують, як правило, препарати високої якості. Змиви зі слизових |
|
||||||||||||
оболонок гомогенізують і концентрують ультрацентрифугуванням або |
|
||||||||||||
ультрафільтрацією. У нативному вигляді, без попереднього очищення |
|
||||||||||||
і концентрації можна досліджувативезикулярну і |
пустульозну |
|
|||||||||||
рідини, суспензію розтертих кірок, носовий секрет |
|
|
|
|
|
||||||||
, а також культуральну |
рідину інфікованої |
культури |
|
клітин та |
|
||||||||
алантоїсну |
рідину заражених |
курячих |
ембріонів |
|
|
після |
|
||||||
ізоляції |
вірусу |
|
|
з |
дослідного |
патологічного |
|
||||||
матеріалу. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Розроблено |
різні |
|
методики |
виготовлення |
|
препаратів |
із |
||||||
вірусовмісних суспензій для електронної мікроскопії. Одним із |
|
||||||||||||
найпоширеніших |
є флотаційний |
метод. |
При |
цьому |
на воскову |
|
|||||||
пластинку наносять краплю вірусовмісної суспензії, на яку вміщують |
|
||||||||||||
на 1 - 2 хв предметну сітку плівкою-підкладкою вниз для адсорбції |
|
||||||||||||
вірусу. Надлишок |
рідини |
на |
сітці |
видаляють |
|
фільтрувальним |
|
||||||
папером. Якщо вірусовмісна суспензія недостатньо очищена від |
|
||||||||||||
баластних |
речовин, |
предметну |
сітку |
з |
адсорбованим |
вірусом |
|
||||||
відмивають, вміщуючи її плівкою-підкладкою вниз на1 — 2 краплі |
|
||||||||||||
дистильованої води; |
надлишок |
вологи |
знімають |
фільтрувальним |
|
||||||||
папером. Далі проводять контрастування препарату, вміщуючи сітку |
|
||||||||||||
на 30 — 50 с на краплю контрастувальної речовини, надлишок якої |
|
||||||||||||
знімають фільтрувальним папером. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
В електронній мікроскопії широко застосовуютьдослідження |
|
||||||||||||
ультратонких зрізів при вивченні структури віріонів і різноманітних |
|
||||||||||||
аспектів взаємодії вірусів із чутливими клітинами іпУІІГО та іп УІУО. |
|
||||||||||||
Дослідний |
об'єкт (шматочки |
органів і тканин, |
осад |
десквамо-ваних |
|
||||||||
клітин змивів, сечі, калу, клітини зараженої культури) потрібно зафіксувати з метою максимального збереження клітинної структури. Для цього найчастіше застосовують2,5%-й розчин глутараль-дегіду або 1%-й розчин чотириокису осмію. Потім об'єкт відмивають від фіксатора ФБР, зневоднюють у зростаючих концентраціях ацетону
або спирту, заливають в епоксидну чи поліефірну смолу і - полі меризують при +95 °С 60 хв або при +40...+80 °С 1 - 2 доби. З отриманих блоків готують на ультрамікротомах зрізи завтовшки150 — 300 А°, які монтують на предметні сітки і контрастують.
Імуноелектронна мікроскопія (ІЕМ) ґрунтується на виявленні в електронному мікроскопі комплексів віріонів з антитілами. При
взаємодії вірусу з антитілами утворюються агрегати , віріонів оточених ореолом з антитіл, які легше виявити в електронному мікроскопі, ніж поодинокі вірусні часточки. Метод ІЕМ чутливіший від електронної мікроскопії в10 - 100 разів. Він дає змогу виявляти віріони при титрі вірусу близько103'5 ЕДбо/см3, а різні способи приготування препаратів можуть підвищити чутливість методу ще на один-два порядки.
В ІЕМ зазвичай використовують нативну сироватку, освітлену
низькошвидкісним |
центрифугуванням |
або |
фільтруванням. Для |
||||
підвищення чутливості методу сироватку освітлюютьультрацент- |
|||||||
рифугуванням або використовують їїглобулінові |
фракції. При |
до- |
|||||
слідженні складно організованих вірусів сироватку прогрівають при |
|||||||
+56 °С 30 хв для інактивації комплементу, який може спричинити |
|
||||||
лізис |
суперкапсидної |
оболонки |
. віріонівНайкращого |
||||
зображення структури віріонів та їхньої |
агрегації |
досягають за |
|||||
оптимальної концентрації антитіл, яку підбирають |
дослідно із |
||||||
різними розбавляннями сироватки. |
|
|
|
|
|
||
Препарати для ІЕМ готують так. Дослідну вірусовмісну суспен- |
|||||||
зію змішують із специфічною сироваткою у співвідношенні 4 : 1 або 5 |
|||||||
: 1, витримують 1 |
год при +37 °С |
і 16 -18 год |
при +4 |
°С, потім |
|||
центрифугують |
при 10 - 15 тис. об/хв для |
осадження імунних |
ком- |
||||
плексів. Осад ресуспендують у кількох краплях дистильованої води, адсорбують на предметну сітку і контрастують.
Метод ІЕМ використовують не тільки для індикації та ідентифікації вірусів у дослідному матеріалі, а й для їхньої серотипізації, а також з метою виявлення і титрування антитіл у сироватках реконвалесцентів.
ВИЯВЛЕННЯ ТІЛЕЦЬ-ВКЛЮЧЕНЬ ВІРУСІВ
У патологічному матеріалі хворих і загиблих тварин при бага-
тьох вірусних хворобах виявляють тільця-включення, природа яких може бути різною залежно від виду вірусу: 1) скупчення віріонів потомства; 2) нагромадження вірусних білків, що не увійшли до складу віріонів потомства; 3) клітинний матеріал, змінений у результаті репродукції вірусу. Здебільшого тільця-включення євірусними «фабриками» — місцями синтезу вірусних білків і нуклеїнових кислот та складання віріонів потомства, включаючи клітинні структури (наприклад, рибосоми, осміофільні волокна).
Тільця-включення класифікують:
1)за локалізацією в клітині: внутрішньоядерні (типів А і В) і цитоплазматичні;
2)за складом нуклеїнової кислоти: ДНК- і РНК-вмісні; 3)за тинкторіальними властивостями: базофільні (фарбуються
основними барвниками) й оксифільні, або ацидофільні (фарбуються кислими барвниками);
4) за гомогенністю: аморфні, зернисті, гранулярні й волокнисті.
Як правило, ДНК-вмісні віруси утворюють внутрішньоядерні тільця-включення, а РНК-вмісні — цитоплазматичні. Проте є
винятки. Так, ДНК-геномні віруси віспи формують цитоплазматичні тільця-включення. Невелика група вірусів зумовлює появу тілець- вклю-чень обох типів(наприклад, віруси чуми ВРХ, парагрипу-3 ВРХ).
Деякі тільця-включення отримали назви на честь авторів, які вперше виявили їх: при сказі — тільця Бабеша - Негрі, при натуральній віспі й вісповакцині— тільця Гварнієрі, при віспі птиці— тільця Боллінгера, при інфекційному ларинготрахеїті птиці— тільця Зейфреда, при чумі м'ясоїдних — тільця Лентца, при інфекційному гепатиті м'ясоїдних — тільця Рубарт
Морфологія, тинкторіальні властивості та локалізація тілецьвключень специфічні для кожного вірусу. Тому виявлення їх у патологічному матеріалі хворих або загиблих тварин має діагностичне значення. Це стосується насамперед такої хвороби, як сказ.
Виявлення тілець БабешаНегрі. Тільця Бабеша-Негрі — це скупчення нуклеокапсидів вірусу сказу(без суперкапсидної оболонки) в поєднанні з продуктами клітинної реакції. х виявляють у цитоплазмі заражених клітин: при буйній формі сказу найчастіше в клітинах амонових рогів, а при паралітичній формі — в довгастому і спинному мозку.
Тільця Бабеша-Негрі мають різні розміри(від 0,25 до 25 мкм) і форму (округла, трикутна, яйце-, грушо-, сигароподібна). Найчастіше
трапляються тільця округлої форми, діаметром від 4 до 10 мкм. Вони |
|
|||||||||
оточені оболонкою та містять зернисті включення(від 1 до 15). У |
|
|||||||||
кожному тільці одне або кілька більших зерен займають центральне |
|
|||||||||
положення, а дрібні їх оточують або розміщуються по периферії. |
|
|||||||||
Тільця |
зафарбовуються |
кислими |
фарбами, |
їхня |
внутрішня |
|
||||
зернистість — |
основними. Така |
зерниста |
структура |
дає |
змогу |
|
||||
диференціювати |
тільця |
|
Бабеша- |
Негрі |
|
від |
інших |
|
||
внутрішньоклітинних включень. |
|
|
|
|
|
|
|
|||
Кількість |
і розміри тілець залежать від тривалості хвороби. |
|
||||||||
Тільця Бабеша - Негрі з'являються за3 - 4 доби до появи перших |
|
|||||||||
клінічних ознак хвороби. Чим довший інкубаційний період, тим ін- |
|
|||||||||
тенсивніше вони розвиваються: більші їхня кількість, розміри і чіт- |
|
|||||||||
кіше |
виражена |
внутрішня зернистість. Тільця Бабеша-Негрі ви- |
|
|||||||
являють у 65 - 85 % випадків сказу. |
|
|
|
|
|
|
|
|||
Для індикації в патологічному матеріалі тілець БабешаНегрі |
|
|||||||||
готують гістозрізи з різних відділів головного мозку: кора великих |
|
|||||||||
півкуль, мозочок, довгастий мозок, амонів ріг (не менше двох пре- |
|
|||||||||
паратів із кожного відділу). Для виявлення тілець Бабеша-Негрі |
|
|||||||||
використовують |
різні методи фарбування, найчастіше за Муромце- |
|
||||||||
вим або Селлером. |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
Фарбування за Муромцевиж. |
|
|
|
|
|
|
|
||
1.Фіксація свіжих, вологих'препаратів у етиловому або метиловому |
|
|||||||||
спирті 1-2 год за кімнатної температури або15 - 20 хв при +50...+70 |
|
|||||||||
°С; промивання дистильованою водою. |
|
|
у25 см3 бідисти- |
|
||||||
2.Синька Мансона 1 : 40 (2 г бури розчиняють |
|
|||||||||
льованої води при кип'ятінні, додають у гарячий розчин0,5 г мети- |
|
|||||||||
ленової синьки і доводять бідистильованою водою до1 дм3) — 5-10 |
|
|||||||||
хв. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3.5 - 10%-й розчин таніну — 5 - 10 хв до появи блакитного від- |
|
|||||||||
тінку; промивання дистильованою водою, висушування фільтрува- |
|
|||||||||
льним папером. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4.Абсолютний спирт або суміш абсолютного спирту з ацетоном |
|
|||||||||
(1:1) — кілька секунд; висушування на повітрі. |
|
|
|
|
||||||
Препарати |
розглядають |
у |
світловому |
мікроскопі |
під |
|||||
імерсійною олією. Фон і цитоплазма нервових клітин блідо-блакитна, ядра сині,ядерця темно-сині, еритроцити оранжево-червоні, а тільця Бабеша — Негрі різко окреслені, фіолетового кольору з рожевим відтінком і темно-синьою зернистістю.
Фарбування за Селлером.
На свіжі, вологі препарати наносять на10 - ЗО с фарбу, яка складається із суміші 1%-х розчинів основного фуксину(1 частина) і