Питательные среды для культивирования лептоспир

Водно-сывороточная среда. Разлитый во флаконы фосфатный бу­ферный раствор (рН 7,2-7,4) автоклавируют при 115°С 30 минут. К охлажденному буферному раствору добавляют 5-10% инактивированной при 56-58°С в течение 1 ч сыворотки крови кролика или бара­на, фильтруют через фильтр Зейтца и разливают в пробирки. Для про­верки на стерильность среду выдерживают при 37°С в течение 3-5 суток.

Среда Ферворта-Вольфа в модификации Тарасова. К 900 мл дистил­лированной воды добавляют 0,5 мл хлорида натрия, 1 г пептона, 100 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,2) и автоклавируют при 115°С 30 минут. Полученную смесь дважды фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 5 мл в пробирки и автоклавируют при 115°С 30 минут. В каждую пробирку вносят по 0,5 мл стерильной сыворотки крови кролика или барана, прогревают при 56-58°С 30 минут. Для проверки на стерильность среду выдерживают при 37°С в течение 3-5 суток.

Полужидкая среда Флетчера. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 2 г агара и кипятят 30 минут. Затем разливают по 5 мл в про­бирки и автоклавируют при 0,8 атм. 30 минут. После охлаждения в каж­дую пробирку вносят по 0,5 мл стерильной сыворотки крови кролика или барана, инактивируют при 56-58°С 30 минут. Проверяют на стериль­ность в течение 3-5 суток при 37°С.

Бактерии рода Mycobacterium

Это бактериальные клетки с характерным свойством кислотоустойчивости являются свободноживущими или паразитами позвоночных. Виды данного рода могут быть ошибочно приняты за другие близкие роды. Свойство кислотоустойчивости, обусловленное присутствием восков в клеточных стенках, особенно важно для типирования микобактерий. Эти бактерии не обесцвечиваются под действием подкисленного спирта или сильных неорганических кислот после окрашивания. Некоторые другие бактерии частично кислотоустойчивы, они легко обесцвечиваются спиртом, но могут быть устойчивы к действию слабой кислоты.

В состав рода Mycobacterium включены кислото- и спиртоустойчивые (признак особенно выражен у паразитических видов) аэробные неподвижные грамположительные прямые или изогнутые палочковидные бактерии. Иногда они образуют нитевидные или мицелиальные структуры, фрагментирующиеся при легком механи­ческом воздействии на палочки или кокковидные элементы. Характерно высокое содержание липидов и восков (до 60%) в клеточных стенках, образованных пептидогликано-арабиногалакта­но­вым комплексом; некоторые виды образуют каротиноидные недиффундирующие пигменты. Каталазо- и арилсульфатазоположительны; резистентны к действию лизоцима. Растут медленно или очень медленно, видимые колонии появляются через 2-60 суток при оптимальной температуре. Колонии часто розовые, оранжевые или желтые, особенно при росте на свету. Пигмент не диффундирующий, поверхность колоний обычно матовая или шероховатая (сапрофитные виды растут несколько быстрее). Характерные биохимические признаки медленнорастущих патогенных микобактерий представ­лены в табл. 23. Микобактерии широко распространены в окружающей среде — воде, почве, на растениях и животных. Несмотря на то, что в настоящее время идентифицировано около 50 видов, некоторые авторы считают, что род насчитывает около 200 паразитических и сапрофитных видов; типовой вид — Mycobacterium tuberculosis. По признаку патогенности выделяют собственно патогенные, вызывающие конкретные заболевания, и атипичные микобактерии. Для систематики последних предложены различные классификации, основанные на генетическом сходстве с Mycobacterium tuberculosis или сходстве с сапрофитными видами; среди предложенных вариантов наибольшее распространение нашла классификация Раньона (1959), в основу которой положены два свойства — цвет колоний и скорость роста. Она выделяет 5 групп микобактерий — патогенные (Mycobacterium tuberculosis, M.leprae, M. bovis, M. microti и М. lepraemurium) и 4 группы атипичных микроорганиз­мов:

1. фотохромогенные микобактерии, приобретающие темно-оранжевую окраску только при выращивании на свету;

2. фотохромогенные микобактерии, приобретающие ярко-оранжевую окраску независимо от того, выращивались ли они на свету или в темноте;

3. нефотохромогенные микобактерии, колонии их могут быть неокрашенными или иметь желтовато-оранжевые оттенки независимо от оссвещенности;

4. быстрорастущие микобактерии - за неделю при температуре 25°С и 37°С образуют колонии.

Знание микобактерий этих групп необходимо для дифференциации от патогенных микобактерий.

Основные микобактерии, патогенные для человека, представлены в табл. 24. Бактерио­логические методы идентификации различных микобактерий включают определение следующих параметров: способность к образованию пигмента, скорость роста, рост при разных температурах (табл. 25), способность к росту на МПА, формы колоний и микроколоний, толерантность к NaCI и некоторые биохимические особенности.

Mycobacterium tuberculosis (палочка Kоxa).

Возбудитель туберкулеза человека — хронического инфекционного заболевания, характеризующегося поражениями органов дыхания, кос­тей, суставов, кожи, мочеполовых и некоторых других органов. Заболевание известно с глубо­кой древности. Легочная форма туберкулеза описана античными авторами (Аретеем Каппадокийским, Гиппократом и др.). Однако древние авторы не рассматривали его как ин­фекцию, а Ибн-Сина вообще считал его наследственной болезнью. Первым прямо указал на его инфекционную природу Фракасторо, а Сильвий отметил связь легочных бугорков с чахоткой.

Таблица 23. Биохимические признаки патогенных, медленно растущих микобактерий

Активность	М. mariпит	М.tuber­culosis	М. bovis*	М. avium**	М. kansasii	М. scrofu-laceum
Уреаза	+	+	+	–	+	+
Пиразинамидаза (в агаре)	+	+	—	+	±	+
Кислая фосфатаза	+	+	+	–	+	–
Восстановление нитратов	–	+	–	–	+	±
-эстераза	–	+	+	+	–	±
Каталаза	±	–	–	±	+	+
Аккумуляция ниацина	–	+	–	–	–	–
Гидролиз твина (через 10 сут)	+	±	—	—	+	–

* комплекс М. bovis включает М. bovis, BCG и М. africanum.

** комплекс М. avium включает М. avium и М. intracellulare.

Многообразие клинических проявлений туберкулеза (или, как его называли, чахотки) обусло­вило много ошибочных представлений; де Лаэннек относил легочные бугорки к злокачествен­ным новообразованиям, и даже великий Вирхов не связывал казеозный некроз с туберкулезным процессом. Рост городов, скученность населения и низкий санитарный уровень жизни привели к тому, что в XVIII-XIX вв. туберкулез собирал обильную жатву среди разных слоев населения: достаточно вспомнить Моцарта, Шопена, Некрасова, Чехова и др. Инфекционная природа заболевания была впервые доказана Вильменом (1865), а важнейшим этапом в изучении и совершенствовании мер борьбы с туберкулезом стало короткое сообщение Коха на заседании Берлинского физиологического общества 24 марта 1882 г. об этиологии туберкулеза, в котором он изложил основные постулаты-критерии для оценки патогенности любого микроорганизма.

Распространение

Резервуар Mycobacterium tuberculosis — больной организм; основной путь заражения — аэрогенный, реже через кожу и слизистые оболочки. В редких случаях возможно трансплацентарное инфицирование плода. Проникновение микобактерий далеко не всегда вызывает развитие патологического процесса; особую роль играют неблагоприятные условия жизни и содержания.

Таблица 24. Патогенные для человека микобактерии и их свойства

Вид	Резервуар	Патогенность для человека	Основные поражения	Возможность пере­дачи от человека человеку
М. tuberculosis	Человек	+++	Туберкулез	Да
М. bovis	Животные	+++	Туберкулез	Редко
М. kansasii	ООС	+	Туберкулезоподобные поражения	Очень редко
М. scrofulaceum	ООС	+	Лимфадениты	Нет
М. aviumimracellulare	ООС, пти­цы	+	Туберкулезоподобные поражения	Нет
М. fortuifum	ООС	+	Кожные абсцессы	Нет
М. marinum	Вода, рыбы	±	Кожные гранулемы	Нет
М. ulcerans	ООС	±	Кожные язвы	Нет
М. leprae	Человек	+++	Проказа	Да

ООС — объекты окружающей среды.

Морфология и тинкториальные свойства

Тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки размерами 1-100,2-0,6 мкм, со слегка закругленными концами; в цитоплазме содержат зернистые образования. Морфология существенно варьирует в зависимости от возраста культуры и условий культивирования — в молодых культурах палочки более длин­ные, а в старых склонны к простому ветвлению. Иногда образуют кокковидные структуры и L-формы, сохраняющие инфекционность. Неподвижны, спор не образуют, лишены капсул, но имеют микрокапсулу, отделенную от клеточной стенки осмиефобной зоной. Кислотоустойчивы, что обусловлено высоким содержанием липидов (от 30,6% до 38,9%) и миколовой кислоты с длинными цепями атомов углерода (до 80) в клеточной стенке. Образуют кислотолабильные гранулы, преимуще­ственно состоящие из метафосфата (зерна Муха), располагающиеся свободно либо в ци­топлазме палочек. Грамположительны, анилиновые красители воспринимают плохо; по Циль-Нильсену окрашиваются в ярко-красный цвет, по Муху-Вайссу — в фиолетовый (йодофильность); гранулы также окрашиваются в соответствующий цвет.

Культуральные свойства

Аэробы, но способны расти в факультативно анаэробных условиях; 5-10% содержание СО₂ способствует более быстрому росту. Размножаются делением, процесс проходит очень медленно, в среднем за 14-18 ч. Оптимум температурный — 37-38°С, рН 7,0-7,2 (растет в пределах 4,5-8,0).

Таблица 25. Основные дифференциально-диагностические морфологические и ростовые характеристики микобактерий

Вид	Колонии		Рост
	Морфология	Пигмент*	Скорость**	Температура
М. tuberculosis	R-колонии	Н (кремовые)	Медленная	31-37
М. bovis	Мелкие, прозрачные R-колонии	Н (бесцветные или кремовые)	Медленная	37
М. africanum	R-колонии	Н	Медленная	37
М. aviumintracellulare	Мелкие, выпуклые, мутные S-колонии, реже R-диссоциаты	Н (иногда окрашены)	Медленная (более 8 нед)	37 (оптимум): растет от 25 до 45
М. scrofulaceum	Круглые S-колонии	С (желто-оранжевые)	Медленная	25-37
М. kansasii	R-колонии, содержат кристаллы -каротина	Ф (редко Н или С)	Медленная	25-37
М. fortuitumcheloneae	S- и R-колонии	Н(кремовые)	Быстрая	25-40
М. xenopi	S-колонии с выростами	Н(С)	Медленная	42-43 (оптимум)
М. szulgai	S- и R-колонии	С (37°С); Ф(25°С)	Медленная	25-37
М. malmoense	S-колонии	Бесцветные	Умеренная	25-37
M. simiae	S-колонии	Ф (при дли­ тельной экспозиции)	Медленная	37
М. marinum	Неровные, блестящие S-колонии; реже R-диссоциаты	Ф	Умеренная	31-33 (оптимум)
М. haemophilum	R-колонии; реже S-диссоциаты	Н	Медленная	20-32 (оптимум)
М. gordonae	S-колонии	С, оранжевые	Медленная	25-37
М. asiaticum	?	Ф	Медленная	25-37
М. thermoresistible	Чаще S-колонии; реже R-диссоциаты	Ф (желто-оран­жевые, позднее коричневые)	Быстрая	37-45 (оптимум)
М. terratriviale	S- (М. terra) и R- (М. triviale) колонии	Н	Медленная	25-37
М. nonchromogenicum	R-колонии	Н	Медленная	25-37
М. flavescens	S-колонии	С	Умеренная	25-37
М. smegmatis	ЧащеR-колонии; реже S-диссоциаты	Н (кремовые)	Быстрая	25-45
М. shimoidei	R-колонии	Н	Медленная	37

^* Н — нефотохромогенные; С — скотохромогенные; Ф — фотохромогенные.

^** Скорость роста на твердых средах: медленная — рост в течение 4-6 недель; умеренная — рост в течение 2-3 недель; быстрая — в течение 5-7 суток.

Для роста нуждаются в присутствии белкового субстрата и глицерина, а также углерода, хлора, серы, фосфора, азота, факторов роста (биотина, никотиновой кислоты, рибофлавина и др.), ионов (Mg²⁺, К⁺, Na⁺, Fe²⁺). Для выращивания наиболее часто используют плотные яичные среды (Левенштайна-Йенсена, Виноградова, Петраньяни, Дорсе и др.), синтетические и полусинтетические жидкие среды (например, среда Сотона) и др. На жидких средах рост наблюдают на 15-17 сутки в виде сухой морщинистой пленки (R-форма) поднимающейся на края пробирки; среда остается прозрачной. В средах, содержащих детертент (твин-80), дают равномерный рост по толще среды (особенно при периодическом встряхивании). На плотных средах рост отмечают на 14-40 сутки в виде, сухого морщинистого налета кремового цвета; колонии с приподнятым центром, напоминающие цветную капусту, крошковатые, плохо смачиваются водой и имеют приятный аромат. Культуры плохо снимаются со среды, а при прокаливании трещат. Под влиянием антибактериальных препаратов могут диссоциировать с образо­ванием мягких влажных S-колоний либо расти в виде гладких или пигментированных коло­ний. Отличительная особенность Mycobaclerium tuberculosis — способность к синтезу значительного количества никотиновой кислоты, что используют для ее дифференциальной диагностики с прочими микобактериями (ниациновый тест); одно из условий — необходимость посева на среду Левенштайна-Йенсена, не содержащую малахито­вый зеленый (т.к. краситель вступает в реакцию с используемыми реагентами). На средах с желчью образуют сероватый маслянистый налет, образованный удлиненными ветвящимися палочками.

Палочка Коха достаточно устойчива к различным воздействиям; в молоке погибает через 15-20 минут при температуре 60°С; при аналогичной температуре в мокроте сохраняется до часа; при кипячении погибает через 5 минут. Прямой солнечный свет убивает палочку Коха через 45-55 минут, рассеянный свет — через 8-10 суток. Хорошо сохраняется при высушивании (до нескольких недель). Обычные химические дезинфектанты относительно мало эффективны; 5% раствор фенола убивает Mycobacterium tuberculosis лишь через 5-6 ч; возбу­дитель также способен быстро вырабатывать устойчивость ко многим антибактериальным средствам.