Экспрессия белков план

1. Генно-инженерная система бактерий рода Bacillus.

2. Генно-инженерные системы грам-положительных микроорганизмов родов Strptomyces, коринеформных бактерий.

3. Генно-инженерная система дрожжей Saccharomyces.

1. Генно-инженерная система бактерий рода Bacillus.

Cистема клонирования и экспрессии чужеродных генов в грам-отрицательных бактериях имеет определенные недостатки, часть из которых можно преодолеть, используя в качестве клеток — хозяев гибридных молекул ДНК грамположительные бактерии, и прежде всего представителей рода Bacillus.

Основным преимуществом бацилл с точки зрения создания молекулярных векторов является их способность секретировать из клеток в культуральную среду большие количества определенных белков. Это связано с тем, что клеточная стенка у грамположительных бактерий организована более просто, чем у грамотрицательных. Исходя из общности механизмов секреции белков через плазматическую мембрану в клетках различных типов, чрезвычайно заманчиво конструировать методами генетической инженерии гибридные гены, в которых чужеродная кодирующая последовательность состыкована с ген-эквивалентом сигнального пептида какого-либо секретируемого белка Bacillus.

Если детерминируемый таким искусственным геном химерный продукт будет способен секретироваться в культуральную среду, то это значительно упростит очистку изучаемого белка. Возможно, в таком случае чужеродный белок в бактерии будет синтезироваться интенсивнее, чем в варианте без секреции, так как он в меньшей степени будет нарушать метаболизм клеток. Данное направление исследований — изучение механизма секреции, создание векторов экспрессии-секреции — в генетической инженерии бацилл имеет большое практическое значение, и оно развивается наиболее интенсивно. Многие виды бацилл, в том числе и самый изученный из них вид Bacillus subtilis (сенная палочка), активно используются микробиологической промышленностью для производства ферментов, антибиотиков, аминокислот и др. Поэтому разработаны методы крупномасштабного культивирования этих микроорганизмов и очистки продуктов их биосинтеза. В. subtilis — непатогенная бактерия, поэтому она более перспективна, чем Е. coli для создания штаммов, продуцирующих фармацевтические вещества.

Генно-инженерные эксперименты на клетках В. subtilis и других видов рода Bacillus показали перспективность использования этих бактерий для разработки с помощью методов генетической инженерии высокоэффективных технологий микробиологического синтеза различных полипептидов, а также некоторых низкомолекулярных соединений. Генно-инженерная методология способствует бурному развитию молекулярной генетики В. subtilis, позволяет изучать процессы регуляции экспрессии целевых генов.

Трансформация компетентных клеток

Bacillus subtilis относится к тем немногим хорошо изученным видам бактерий, которые обладают физиологической компетентностью. Впервые возможность генетической трансформации клеток В. subtilis препаратом очищенной хромосомной ДНК показал Дж. Спицайзен в 1958 г. Активные исследования, проведенные в последующие годы, позволили относительно подробно изучить этот процесс. У В. subtilis, как и у большинства других бактерий, компетентность возникает лишь на определенном этапе роста культуры. Для того чтобы стимулировать клетки к захвату ДНК, их выращивают на богатой среде, а затем переносят на бедную среду, где отсутствуют аминокислоты, необходимые ауксотрофным мутантам. Максимальная компетентность обычно достигается на поздней стадии логарифмического роста культуры В. subtilis. Такая культура может храниться при температуре -70 °С с сохранением компетентности по крайней мере в течение 6 мес.

Компетентные клетки составляют не более 5-10 % всей популяции бактерий. Они отличаются от некомпетентных клеток по составу клеточной стенки, имеют сниженный поверхностный заряд и повышенную чувствительность к осмотическому шоку. Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что у компетентных клеток имеются участки обнаженной плазматической мембраны. Предполагают, что именно с ними и взаимодействует трансформирующая ДНК. Компетентные клетки характеризуются пониженной метаболической активностью и меньшими размерами по сравнению с обычными клетками.

Процесс формирования компетентного состояния у В. subtilis контролируют не менее семи генов. Белки, обеспечивающие компетентность В. subtilis, участвуют в процессах связывания (адсорбции), проникновения и рекомбинации (интеграции) донорной ДНК. Вскоре после адсорбции в молекуле ДНК происходят двухцепочечные разрывы и она распадается на фрагменты размером около 14 тпн. После этого одна цепь фрагмента ДНК гидролизуется специфичной нуклеазой, а другая проникает в клетку, частично разрушаясь с концов в результате нуклеазной атаки. Полагают, что источником энергии для перемещения ДНК через плазматическую мембрану служит протондвижущая сила. (вещества, снижающие мембранный потенциал, подавляют перенос ДНК в цитоплазму.)

Рис. 70.5. Модели трансформации компетентных клеток В. subtilis разными типами молекул ДНК (1-7).

Этапы трансформации: a — связывание ДНК с компетентными клетками;

б — фрагментация и начало вхождения цепей ДНК в клетку; в — завершение процесса вхождения цепей ДНК; г — комплементарное взаимодействие цепей ДНК внутри клетки (синапсис); д — образование конечных продуктов.

Знание основных этапов хромосомной трансформации клеток В. subtilis упростило разработку системы трансформации компетентных клеток бацилл молекулами плазмидных ДНК. Впервые плазмидную трансформацию В. subtilis осуществил С. Эрлих в 1977 г. Он ввел в данную бактерию плазмиды антибиотикоустойчивости рС194, рС221, рС223, pUB112 и рТ127 из грамположительной бактерии Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк) и доказал, что они способны реплицироваться в гетерологичном окружении и экспрессировать гены устойчивости к антибиотикам.

Кроме того, анализ трансформированных клеток В. Subtilis показал, что плазмидная ДНК проникает в компетентные клетки в виде линейных одно-цепочечных структур. Цепи существенно деградируются с концов, поэтому при введении в компетентные клетки мономерных плазмид для образования трансформанта необходимо, чтобы в клетку попало не менее двух молекул ДНК. Для мультимерных форм плазмид достаточно единичной молекулы, чтобы обеспечить трансформацию.

Существует несколько моделей, описывающих процесс трансформации клеток В. Subtilis плазмидами. При использовании мономерных форм образование полноценной плазмиды если и происходит, то крайне редко, так как плазмидная ДНК, проникая в компетентную клетку, расщепляется в произвольной точке, а образующаяся одноцепочечная молекула гидролизуется с концов нуклеазами.Трансформация клеток бацилл мономерными плазмидами возможна также в том случае, если плазмида содержит протяженные повторяющиеся последовательности. Если повторы в плазмиде прямые, трансформация клеток ее мономерной формой происходит примерно по тому же механизму, что и трансформация мультимерными молекулами ДНК. Трансформация такими плазмидами сопровождается их распадом по повторам.

Рассмотренные подходы позволяют в той или иной мере преодолевать трудности трансформации компетентных клеток В. subtilis мономерными плазмидами. Однако не всегда введение в состав плазмидной ДНК областей гомологии с бактериальной хромосомой или протяженных инвертированных повторов приводит к успешной трансформации клеток мономерными формами таких плазмид. Это означает, что природа вставки, дупликации или самой плазмиды может быть важна для проявления свойств, необходимых для образования внутримолекулярной синаптическои структуры. Например, фрагмент ДНК В. subtilis, содержащий гены рибосомной РНК, не обеспечивает спасения гибридной плазмиды в процессе трансформации компетентных клеток В. subtilis мономерной плазмидой. Полагают, что интенсивная транскрипция генов рРНК препятствует образованию синаптическои структуры между вводимой плазмидой и гомологичным районом хромосомной ДНК.

Универсальные методы введения плазмид.

Необходимость разработки более универсального метода плазмидной

трансформации различных грамположительных бактерий привела исследователей к изучению протопластов этих клеток. Плазмидная ДНК проникает в протопласты в двухцепочечной форме. Трансформация проходит с одинаковой эффективностью при использовании как мономерных суперкольцевой или открытой кольцевой форм, так и мультимерных форм. При этом могут быть трансформированы до 80 % протопластов. Зависимость числа трансформированных протопластов отконцентрации плазмидной ДНК у В. subtilis показывает, что для акта трансформации достаточно одной мономерной молекулы плазмиды.

В процессе трансформации плазмида не претерпевает структурных изменений.Так как плазмида входит в протопласт в виде двухцепочечной молекулы, система рестрикции-модификации клетки-реципиента будет существенно снижать эффективность трансформации при наличии в плазмиде соответствующих сайтов рестрикции. Аналогичная ситуация возникает также при введении в протопласты хромосомной ДНК.

Таким образом, с точки зрения введения плазмид в клетки протопласты бацилл, как и других грамположительных бактерий, имеют ряд несомненных преимуществ перед компетентными клетками. Протопласты с высокой эффективностью трансформируются мономерной формой плазмидных ДНК, что очень важно при конструировании гибридных молекул ДНК in vitro. Кроме того, используя протопласты, часто удается вводить плазмиды в штаммы грамположительных клеток, не обладающих

физиологической компетентностью. Недостатками данного методического приема являются его относительная сложность, многоэтапность и, как следствие, слабая воспроизводимость по параметру эффективности трансформации.

Более прост и универсален метод электропорации, который начиная с 1988 г. стали использовать для бактерий рода Bacillus. По эффективности электропорация примерно соответствует методу протопластов, но значительно проще и быстрее в исполнении. Тем не менее для каждого вида (штамма) процедуру электропорации необходимо оптимизировать, чтобы добиться наибольшего уровня плазмидной трансформации.

Недостаток электропорации, как и плазмидной трансформации протопластов, состоит в том, что проникающая в цитоплазму двухцепочечная молекула ДНК не защищена от атаки эндогенных рестриктаз, что в ряде случаев может значительно усложнять проведение генно-инженерных манипуляций.

Векторы на основе плазмид Bacillus.

Параллельно с развитием векторной системы Bacillus на основе стафилококковых и стрептококковых плазмид велась разработка клонирующих векторов и на основе плазмид, выделенных из разных видов бацилл (табл. 10.4). К. Бернхард с соавторами (1978 г.) показали, что плазмида рВС16 из В. cereus способна реплицироваться и детерминировать устойчивость к тетрациклину в клетках В. subtilis. После гидролиза рВС 16 рестриктазой EcoRl и обработки ДНК-лигазой получена плазмида рВС16-1

(рис. 10.9), реплицирующаяся в клетках В. Subtilis и сохранившая ген tet. Далее рВС16-1 была рекомбинирована in vitro no -EcoRI-участку с критической плазмидой В. subtilis pBS I. Однако в В. subtilis гибридная плазмида, состоящая из двух репликонов, оказалась нестабильной и диссоциировала на pBS161 и pBS162.

Таблица 10.4. Плазмиды бактерий рода Bacillus, использованные для создания клонирующих векторов В. Subtilis

Рис. 10.9. Схема создания плазмиды pBS161-l.

A-G —HindIII-фрагменты плазмид в порядке уменьшения размера

Плазмида	Источник выделения	Размер, тпн	Фенотипические маркеры
рВС16 pPLIO рАВ124 pLS28 pBSl рТВ19	В. cereus В. pumilus В. stearothermophilus В. subtilis В. subtilis	4,5 6,6 4,4 6,2 8,3 25,8	Тсг Kil+ Тсг — — Nmr, Тс

Плазмиду pBS161 гидролизовали рестриктазой Hindlll и фрагменты циклизовали с помощью ДНК-лигазы. После трансформации клеток

B. subtilis в устойчивых к тетрациклину клонах выявили новую плазмиду pBS 161-1, которая представляла собой циклизованный Hindlll-A-фрагмент pBS161. Полученная плазмида имеет единичные участки гидролиза рестриктазами EcoRl, Hindlll, Pstl, встройки по которым не повреждают репликатор и ген tet. Это позволяет применять ее в качестве клонирующего вектора. Недостаток pBS161-l — сложность отбора создаваемых на ее основе гибридных плазмид.

Векторная система секреции чужеродных белков из клеток Bacillus

Одно из самых важных направлений генно-инженерных исследований на В. Subtilis и других бациллах — создание штаммов, секретирующих чужеродные белки из клеток. Бактерии рода Bacillus могут выделять во внешнюю среду различные белки. Хорошо изучена секреция а-амилазы, пенициллиназы и протеаз. Секретируемые белки имеют на N-конце сигнальный пептид, который отщепляется в процессе секреции, давая начало зрелой форме внеклеточного белка. У изученных секретируемых белков Bacillus сигнальные пептиды необычно длинны (29-34 АК) в отличие от встречающихся в грамотрицательных бактериях и клетках животных (15-25 АК).

Клонируя гены секретируемых белков и удаляя затем кодирующую последовательность зрелой формы, можно создать молекулярные векторы экспрессии-секреции для грамположительных бактерий рода Bacillus. В первую очередь данный подход был реализован применительно к гену атуЕ. Этот ген кодирует а-амилазу — один из наиболее изученных и имеющих практическое значение секретируемых ферментов многих штаммов бацилл. Бактериальная а-амилаза используется в промышленном расщеплении крахмала до низкомолекулярных легко усваиваемых дрожжами продуктов (а-мальтозы, а-глюкозы и коротких а-декстринов), которые необходимы для таких микробиологических процессов, как, например, производство этанола. Выявлено не менее шести генов, участвующих в регуляции продукции этого фермента. Кропотливая многоступенчатая селекция позволила создать множество мутантных штаммов Bacillus, наиболее продуктивные из которых превосходят штаммы дикого типа по уровню синтеза а-амилазы в 103 раз. С развитием методов генно-инженерной реконструкции на системе В. subtilis возникла идея получения нового поколения продуцентов а-амилаз. При этом для промышленности большой интерес представляли термостабильные формы данного фермента, гены которых можно было извлекать из ДНК термофилов и вводить в определенное генетическое окружение такого хорошо изученного мезофила, как В. subtilis.