4 Аналитическая методика, выполняемая автоанализатором

Метод: Иммунофенотипирование опуховлевых клеток в костном мозге (КМ) в целях определения минимальной остаточной болезни (МОБ)

Вид анализа: оптический.

Анализатор: проточная цитометр.

Аналит: клетки костного мозга.

Процедура подготовки биопробы:

Цельный КМ в объеме не менее 2 мл забирается в пробирку с калиевой солью этилендиаминтерауксусной кислоты в качестве антикоагулянта. В направлении на определение МОБ, кроме стандартной информации, должны быть указаны тип материала, протокол терапии и этап лечения.

Образец КМ должен быть доставлен для исследования в течение 48 ч при температуре транспортировки 4 °С. Если КМ вязкий, возможно его пропорциональное разведение фосфатно-солевым буфером.

В промаркированные пробирки для проточной цитометрии вносятся первично-меченые антитела в соответствии с используемыми комбинациями маркеров. Вносимый объем раствора антител определяется титрованием и зависит от количества окрашиваемых клеток.

Добавляется необходимый объем цельного КМ, который рассчитывается исходя из клеточности исследуемого образца, определенной на гемоанализаторе. Добавляется соответствующее объему материала количество лизирующего раствора. Образец тщательно перемешивается и инкубируется не менее 15 мин при комнатой температуре в темноте.

Образец отмывается 2 раза в 3 мл фосфатно-солевого буфера pH 7,0. Добавляется 0,5 – 1,0 мл фосфатного-солевого буфера. Готовый образец должен быть проанализирован в течение 2 ч с момента окрашивания.

Интерпретация результатов:

Программное обеспечение, используемое для получения и анализа данных проточной цитофлуориметрии, позволяет с помощью различных инструментов выделять на полученных графиках произвольные группы клеток, определять их процентное соотношение, сравнивать степень выраженности исследуемого признака у разных популяций, проводить статистический анализ и т.д.

Величина МОБ при определении методом проточной цитометрии рассчитывается как процентное содержание опухлевых клеток среди всех ядросодержащих клеток КМ. [2, 5]

5 Внутренний контроль качества

Цель внутрилабораторного контроля качества (ВКК) – оценка соответствия результатов исследований установленным критериям их приемлемости при максимальной вероятности погрешности и минимальной вероятности ложного отбрасывания результатов выполненных лабораторией аналитических серий.

Для проведения внутрилабораторного контроля используются контрольные образцы (КО), содержащие и не содержащие целевой маркер. Их разделяют на 3 группы:

1) Для оценки сходимости результатов, построения контрольной карты и текущего оперативного контроля используется образец КО₁, содержащий целевой маркер. КО₁ не имеет аттестованных значений МОБ, каждая лаборатория получает свои целевые значения в используемых тест-системах.

2) Для оценки чувствительности анализа в лаборатории применяется контрольный образец КО₂ с низким содержанием целевого маркера, значение МОБ, которого превышает МОБ_крит. Значение МОБ_крит позволяет отличать положительные от отрицательных результаты анализа.

3) Для оценки специфичности анализа в лаборатории применяется контрольный образец КО₃, не содержащий целевого маркера, значение МОБ которого должно быть ниже МОБ_крит.

ВКК состоит из трех последовательных этапов:

1) Оценка внутрисерийной воспроизводимости методики

На первой стадии в аналитической серии проводятся 10 измерений образца КО₁.

Из полученных 10-ти значений рассчитывают коэффициент внутрисерийной вариации методики CV₁₀ и сравнивают с табличным. Приведенные в таблице предельно допустимые значения коэффициентов вариации CV_сход получены эмпирическим путем на основании анализа результатов выявления образцов КО₁.

Вычисленное значение CV₁₀ в лаборатории должны быть меньше полученного в рамках программы внешней оценки качества предельно допустимого значения CV_сход. Если вычисленный CV₁₀ для данного серологического маркера превышает табличное значение, следует провести работу по снижению внутрисерийной вариации результатов данного вида анализа.

Интерфейс для оценки внутрисерийной воспроизводимости методики представлен на рисунке 6.

Рисунок 6 – Интерфейс для оценки внутрисерийной воспроизводимости методики

2) Оценка смещенеия и коэффициента общей аналитической вариации методики (построение контрольной карты)

На второй стадии в установочной серии – 20 измерений. КО₁, КО₂ и КО₃ в 20-ти аналитических сериях. Если КО₂ определяется как положительный, а КО₃ как отрицательный, то значение КО₁ принимается.

По результатам 20 аналитических серий рассчитывают МОБ_ср, их средние квадратические отклонения S и коэффициенты вариации CV₂₀:

Полученный результат CV₂₀ сравнивают с предельно допустимым табличным CV_воспр. Вычисленное значение CV₂₀ в лаборатории должны быть меньше предельно допустимого значения CV_воспр.

Для МОБ_ср рассчитывают контрольные пределы ± 3S. После получения удовлетворительных показателей КО₁, КО₂ и КО₃ переходят к этапу построения контрольной карты по значениям КО₁. Из 20-ти полученных результатов вычисляют среднюю арифметическую величину МОБ_ср, среднее квадратическое отклонение S и контрольные пределы ±3S.

Интерфейс для оценки смещенеия и коэффициента общей аналитической вариации методики представлен на рисунке 7.

Рисунок 7 – Интерфейс для построения контрольной карты

3) Текущий внутрилабораторный контроль качества

На третьей стадии проводится оперативный контроль с применением КО₁, КО₂ и КО₃.

Вычисленное при оценке результатов значение МОБ_крит. Должно попадать в ранее рассчитанный интервал значений МОБ_ср ± 3S. Если значение МОБ_крит находится вне указанных пределов, необходимо найти ошибки, устранить их и провести анализ заново. Если значение МОБ_крит. находится в установленном интервале, то переходят к оценке КО₂ и КО₃. Если КО₂ не определяется как положительный и/или КО₃ не определяется как отрицательный, то значение КО₁ не засчитывается, необходимо найти ошибки, устранить их и провести анализ заново. В противном случае значение КО₁ засчитывается и наносится на карту. Оценку результатов исследования контрольного материала КО₁ проводят с использованием контрольных правил Вестгарда. [6]

Интерфейс для оценки смещенеия и коэффициента общей аналитической вариации методики представлен на рисунке 8.

Рисунок 8 – Интерфейс для текущего внутрилабораторного контроля