Приготовление фенола

Приготовление фенола для выделения DNA, RNA.

• Скорость окисления фенола увеличивается с увеличением pH, температурой и концентрацией. Что бы минимизировать окисление рекомендуется вначале насытить фенол водой, а затем уравновешивать буфером по мере надобности.

• Окисленный фенол становится желтым или красным при насыщении водой или буфером.

Насыщение водою.

1. Достать бутылку с кристаллическим фенолом из холодильника, согреть до RT, ослабить крышку

2. Поставить в горячую воду, нагреть до +65С, пока не расплавитсо. Замечание: если банка фенола 100 гр., то его лучше весь сразу насыщать водою прямо в банке (свободное место там обычно предусмотрено). Если банко 1кг, то отлить сколько надо и остаток хранить на +3С под азотом.

3. Заполнить 100 гр-ю. баку фенола деионизованной стерильной водой до горлышка (вообще достаточно 1/5-й от объёма фенола, ведь 100гр фенола насыщаются 12,36 мл. воды).

4. Хорошо закрутить крышку и встряхнуть, чтоб водная и органическая фазы образовали качественную эмульсию.

5. Поставить на +3С, чтоб фазы разделились (в течение 8-16 часов).

6. Отсосать верхний водный слой.

7. Разделить фенол на небольшие объёмы, достаточные для 1-го – 2-х раз использования.

8. Добавить стерильной деионизованной воды, чтоб покрыть ею слой фенола.

9. Хранить при +3С защищённом от света месте. Лучше использовать бутылки из стекла янтарного цвета, обёрнутые фольгою. В таком виде фенол будет стабилен несколько месяцев (минимум 3). Замораживать фенол не рекомендуется.

Такой фенол имеет pH около 4.7-5.5. Далее его следует уравновесить Трис-HCl буфером. При высоких pH фенол быстро окисляется, поэтому рекомендуется, чтоб pH буфера для уравновешивания фенола не превышала 8,0. Если очень хочетсо, можно добавить 8-гидроксихинолин до 0.1% (относительно фенольной фазы), он будет в роли антиоксиданта.

Насыщение фенола буфером с Tris-HCl

1. В чистую стерильную стеклянную или полипропиленовую ёмкость налить нужное количество водонасыщенного фенола и добавить такой же объём 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0).

2. Хорошо перемешать и выдержать при комнатной температуре (20-25С) пока не разделятся фазы (можно открутить, чтоб ускорить процесс).

3. Отсосать верхнюю водную фазу.

4. Добавить тот же объём 0.1-M Tris-HCl (pH 8.0). Повторить шаг 2.

5. Проверить pH водной фазы с помощью индикаторной бумажки. Повторять шаги 3 и 4, пока pH не станет 7,0 – 8,0 (идеально – 7,4).

6. Хранить при +3С в защищённых от света бутылках около 1-го месяца.