3.11. Проточная цитофлуориметрия.

Появление высокочувствительных фотодетекторов (фотоэлектронных умножителей), лазерных источников света (позволяющих получать практически монохроматическое высокоинтенсивное излучение), разработка методик мечения биологических молекул флуоресцентными метками с высоким квантовым выходом фотолюминесценции и создание достаточно мощных для быстрой обработки большого объема информации компьютеров позволили разработать специальные флуориметрические устройства для индивидуальной оценки свойств отдельных клеток в клеточных суспензиях (в т.ч. в цельной крови). Такие устройства носят название проточных цитофлуориметров. Схема такого цитофлуориметра и краткое описание принципов его работы приведены на рис. 28

Следует отметить, что разработка проточных цитофлуориметров стала возможна только после того, как было выяснено, что каждый тип клеток несет на своей поверхности специфические антигены (так называемые маркёрные антигены), которые не экспрессируются клетками других типов. Были получены моноклональные антитела против каждого из подобных антигенов, и флуоресцирующие производные этих антител (а также - антител против данных антител), меченные ковалентно присоединяемыми флуоресцентными метками. Наборы подобных антител против клеточных маркеров семейства CD (CD - кластер дифференцировки, англ. cluster of differentiation, cluster designation - номенклатура дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека. Данная классификация была предложена в 1982 году для идентификации и исследования поверхностных мембранных белков лейкоцитов. CD-антигенами или CD-маркёрами могут быть белки, которые служат рецепторами или лигандами, участвующими во взаимодействии клеток между собой и являющимися компонентами каскада определённых сигнальных путей. Но они могут быть и белками, выполняющими другие функции, например, белками клеточной адгезии. Список CD-антигенов, внесённых в номенклатуру, постоянно пополняется и в настоящее время содержит 350 CD-антигенов и их подтипов) время коммерчески доступны. В качестве флуоресцентных меток обычно используются возбуждающиеся и фотолюминесцирующие в видимой области красители, либо флуорофоры на базе так называемых «квантовых точек» (см. ниже).

Рисунок 28. Схема устройства проточного цитофлуориметра. Исследуемая суспензия клеток, которые были предварительно обработаны тем или иным набором флуоресцентно-меченных моноклональных антител против маркерных антигенов с помощью насоса высокого давления прогоняется через форсунку с диаметром выходного отверстия около 100 мкм. Далее клетки по одной попадают в проточный капиллярный канал, где освещаются излучением лазера (иногда в приборе бывают установлены несколько лазерных источников, испускающих свет в разных спектральных диапазонах). Во время прохождения через лазерный пучок вторичное излучение клеток анализируется набором фотоэлектронных умножителей, каждый из которых измеряет интенсивность свечения в спектральной области, соответствующей зоне флуоресценции какой-либо из флуоресцентных меток, которыми были обработаны исследуемые клетки. Регистрируются также интенсивности рассеянного клеткой под прямым углом излучения и прямо проходящего света лазера. Сигналы всех фотоэлектронных умножителей попадают в компьютер, где происходит обработка полученных данных.

Регистрируемая интенсивность свечения каждой метки на каждой из проходящих через пучок лазера клеток (напомним, клетки двигаются в капиллярной проточной кювете строго по одной, см. рис. 28) запоминаются компьютером. После того, как через лазерный пучок прошло заранее задаваемое количество клеток (зарегистрировано определенное количество «клеточных событий»), на основании полученной информации рассчитываются распределения клеток по размеру (рассчитываемым на основании времени прохождения клетки через лазерный пучок), по экспресии тех или иных антигенов и т.д. Получаемая информация позволяет оценить качественный и количественный состав исследуемой клеточной суспензии, функциональное состояние отдельных групп клеток (например, активация лейкоцитов обычно сопровождается появлением на их поверхности антигенов, которые отсутствуют у покоящихся клеток данного типа). Можно также определить долю погибших клеток в исследуемом образце и даже установить механизм их гибели (антигенные детерминанты и размеры у клеток, погибших по механизму некроза, отличаются от таковых у клеток, погибших вследствие апоптоза).

Очень важной областью применения проточной цитофлуориметрии стала диагностика гемобластозов, поскольку каждый тип патологических (лейкозных) клеток имеет свои маркерные антигены. Соответственно, выявив присутствие в крови больного клеток с определенным (присущим только конкретному типу гемобластоза) набором маркерных антигенов, можно точно диагностировать наличие гемобластоза данного типа. Количество же таких клеток в крови указывает на тяжесть течения патологии на момент обследования пациента.