Практическая часть

В работе анализируются (1) зависимость светорассеивания в суспензии эритроцитов от концентрации этих клеток и (2) кинетики гемолиза в эритроцитарных суспензиях, вызванного хлорамином В.

Целью работыявляется овладение методом турбодиметрического анализа лизиса клеток.

Работа проводится на фотоэлектрическом колориметре КФК-2, модифицированном для проведения турбодиметрических измерений. С этой целью в кюветном отделении прибора установлена магнитная мешалка, позволяющая перемешивать исследуемый образец, а сигнал с фотодетектора прибора (вакуумного фотоэлемента) выводится на аналого-цифровой преобразователь (ЛА-70) и регистрируется в режиме реального времени с помощью соответствующего программного обеспечения на персональном компьютере (см. Приложение 1. Работа с аналогово-цифровым преобразователем ЛА-70).

Порядок проведения измерений

Измерение светопропускания эритроцитарной суспензии

1. Открыть кюветное отделение фотоколориметра.

2. Включить фотоколориметр КФК-2 кнопкой «Сеть», расположенной слева от регистрирующей шкалы прибора. Должен включиться источник света фотоколориметра.

3. Включить источник питания мешалки (расположен на корпусе компьютера) с помощью его сетевого выключателя. Включить блок управления мешалкой (закреплен на корпусе фотоколориметра справа от регистрирующей шкалы прибора), переведя имеющийся на нем выключатель в положение «ON». Убедиться, что мешалка в кюветном отделении заработала. Если мешалка не работает, повернуть регулировочную ручку на блоке управления мешалкой по часовой стрелке до упора, а затем установить такие обороты, которые достаточны для предупреждения оседания эритроцитов в кювете во время записи кинетик (обычно для этого требуется установить ручку-регулятор в положение 7-8). Выключить мешалку выключателем на блоке управления мешалкой.

4. Поместить в кювету фотоколориметра перемешивающий магнит («мешалку»). Налить в нее 5 мл физиологического раствора. Установить кювету с физиологическим раствором в кюветное отделение таким образом, чтобы магнит, закрепленный на моторе мешалки, располагался точно напротив боковой стенки кюветы и «захватил» находящуюся внутри кюветы «мешалку». Включить мотор мешалки выключателем на блоке управления. Убедиться, что мешалка работает нормально и эффективно перемешивает объект. При правильной установке кюветы магнит мотора мешалки не должен задевать за стенку кюветы. Если это происходит, следует выключить мешалку и исправить положение кюветы, а затем снова включить мешалку.

5. Закрыть крышку кюветного отделения фотоколориметра. Отметить величину отклонения стрелки его регистрирующего прибора – эта величина сигнала, соответствующего образцу с пропусканием 100% (J₁₀₀)

6. Открыть крышку кюветного отделения прибора. Добавить в кювету с помощью микропипетки 0,1 мл маточной эритроцитарной суспензии (она будет разведена в 50 раз). После распределения введенных клеток по всему объему образца закрыть кюветное отделение и отметить величину отклонения регистрирующей стрелки КФК-2. Это величина сигнала, соответствующего эритроцитарной суспензии с нулевой степенью гемолиза (J_эс). Её светопропускание (Т₀) рассчитывается по формуле:

Регистрация кинетик гемолиза

1. Для регистрации кинетик гемолиза включить компьютер и активировать программу управления аналогово-цифровым преобразователем ЛА-70. Программа активируется двойным «кликом» мыши на ее значок, расположенный на рабочем столе. Убедитесь, что настройки программы соответствуют требуемым (см. Приложение1. Работа с аналогово-цифровым преобразователем ЛА-70), а запись результатов будет производится в нужный вам файл данных. Если файл данных еще не создан, его необходимо создать и указать путь к нему в соответствующем подменю программы управления ЛА-70. Имейте в виду, что при каждом повторном измерении необходим новый файл данных. Если его не создать и не указать, новые данные будут сохраняться в ранее использовавшемся, а содержащаяся в старом файле данных информация будет утрачена.

2. Повторить выполнение пунктов 1-5 раздела Измерение светопропускания эритроцитарной суспензии.

3. Начать регистрацию кинетики изменения светопропускания исследуемого объекта, нажав указателем мыши на кнопку «Старт» в окне управляющей программы ЛА-70. Убедиться, что регистрация началась. Регистрировать кинетику изменений J₁₀₀на протяжение не менее 60 секунд.

4. Не прерывая регистрации, открыть крышку кюветного отделения прибора. Добавить в кювету с помощью микропипетки 0,1 мл маточной эритроцитарной суспензии (она будет разведена в 50 раз). После распределения введенных клеток по всему объему образца закрыть кюветное отделение. Регистрировать кинетику изменения J_эс в течение 60 секунд.

5. Не прерывая регистрации, открыть крышку кюветного отделения прибора. Добавить в кювету с помощью микропипетки 0,2 мл раствора хлорамина В (он будет разведен в 25 раз). Закрыть крышку кюветного отделения.

6. Регистрировать кинетику изменения светопропускания образца в течение 30 минут. Время регистрации задается настройками аналогово-цифрового преобразователя ЛА-70 (см. Приложение1. Работа с аналогово-цифровым преобразователем ЛА-70). По окончании регистрации данные при правильных настройках ЛА-70 будут автоматически сохранены в файле, указанном как место сохранения данных в соответствующем подменю управляющей программы.

7. Обработка полученных данных производится в программе «MicrosoftExel».

Задания работы