заочка / 11_12_13_16_17_18_19_20

11предмет и этапы развития биотехнолгии Биотехнология – пром исп-ие биол проц0в на основе м/о, культур кл и ткан, и отдел сртр-р и комп кл жив и раст с задан-ми св-ми. Назв науки происх от греч слов: биос – жизнь, teken - искуство, логос – наука. Ее становление ученые делят на 4 периода (Блинов 1995г.):

1. Эмперический (греч – опытный) – доисторический, самый длит, охват около 8000 лет, древ народы методом проб и ошибок науч-сь изгот-ть пиво и хлеб. Молоч-кисл прод нач получать позднее, стали делать квашен капусту, силосование, медо-вуху, мочку волокнис раст.

2. Этиологический (причины) охватыв 2 полов 19в и 1/3 20в. Связан с Луи Пастером, основопол научной микробиол. (Кох, Листер, Ивановский). 1982г – вирус тобачной мозайки. Доказали индивид-ть м/о, получили их в чистых культурах, научились их размн-ть в пит ср, исп-ть в целях воспроиз-я. Началось получ-е ацетона, бутанола, лимон и молоч к-т. Клюйвер и Перкин в 1933 разраб теорию и технич подходы глубин культ-я.

3. Биотехнологический началось внедр в биот-ию крупно-масшт-го гермет-го оборуд-я. Началось произ-во антибиот (1939-45). За 40 лет этого периода были решены осн задачи по констр-ию, созд и внедр в практику необх оборуд – био-реакторов.

4. Генотехнический (возникновение) с 1972г. С работ Крика и Уотсона по установл стр-ры ДНК. В 1982г поступ в продажу чел инсулин, выраб киш палочкой, кот несет в себе искус-но встроенную ген инф-ю об этом гормоне. Также получили интерферон, фактор никротиза-ции опухоли TNF интерлейкин-2, соматотропный гормон. Цели: 1)активация и поддерж-е путей обмена кл, ведущих к накопл задан прод при домин-ии над др р-циями обмена у культ-го орг-ма, 2)получ кл или их сост-ых частей (преим ферм-в); для направленного измен-я слож молекул (рестриктаза, изомераза, пеницилинамидаза). 3)углубление и соверш-е форм рДНК для биот-ии и кл инжен-ии. 4)создание безотход и экол-ки безоп биот-их проц, 5) соверш-е и оптимиз-я аппарат-го оформления биотехн-их проц-в с целью достиж max выходов конеч прод при культ-ии естеств видов с измен наследст-тью методами клет и генной инженерии, 6) повышение техникоэкономич показ-лей биотехн проц-в по сравн с сущ-ми. Объекты и методы биотехнологииии: вирусы, бактерии, грибы – микро- и макромицеты, протозойные организмы, кл (ткани) растений, жив и чел, нек биогенные и функц-но сходные с ними в-ва (ферменты, простагландины, лектины, НК). Объекты биот-ии м.б. представлены организ-ми частицами (вирусы), кл (ткани) или их метаболитами (первичные, вторичные). Методы биотехнологииии – крупномасштабное глубин культивирование биообъектов в период, полунепрерывном или непрерывном режиме, выращ-е кл растит и жив тканей в особых усл. Другие методы явл общими, напр с методами в микробиол, биохимии, биоинженерии, орг химии, т.д. Следует особо выделить методв клет и генной инженерии, когда в экспер-ых усл удается созд-ть клетки с заведомо известными свойствами.

12 Технология рекомбинантных ДНК.

Рестриктазно-лигазный 1) Определённой рестриктазой (Eco RI) разрезают молекулу ДНК, содержащую сайты узнавания, на фрагменты, которые несут идентичные взаимокомплементарные липкие концы. 2) Препараты различных молекул ДНК тоже гидролизуют этой рестриктазой, смешивают их и подвергают отжигу, т.е. реассоциации фрагментов за счёт комплементарных взаимодействий по их липким концам одной и той же специфичности. 3) Добавляют в реакционную смесь фермент ДНК-лигазу, которая катализирует ковалентное объединение ассоциированных фрагментов ДНК, в том числе исходно принадлежащих к разным молекулам ДНК (щелочная фосфатаза E. coli).

Коннектор – объединение двунитевых фрагментов ДНК путём наращивания (ферментативного) на их концах однонитевых комплементарных участков. К 3'-концу с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы присоединяется олиго-dA сегмент, а к концу другого сегмента – олиго-dT сегмент. Затем молекулу обрабатывают ферментами ДНКpol 1 и ДНК-лигазой.

Создание линкерных последовательностей – основан на введении во фрагмент ДНК искусственных сайтов рестрикции (короткий фрагмент ДНК с тупым концом, содержащий последовательности для разрезки специфическими рестриктазами). Их получают химическим синтезом, присоединяя к ДНК с помощью ДНК-лигазы фага Т 4. Гидролизуют рестриктазой для получения липких концов. Внутренние сайты рестрикции метилируют.

Способы получения гена. Выделение из ДНК: воздействием рестриктаз, гидродинамическим способом или ультразвуком.

Химический или ферментативный синтез. Очень трудно в связи с вырожденностью генетического кода. Используют для генетического зондирования при ДНК-ДНК-, ДНК-РНК-гибридизации, для праймеров (коротких цепочек ДНК, используемых в качестве затравок синтеза ДНК при ферментативном синтезе). Исходным материалом являются дезоксирибонуклеозиды. Они связываются 3' – 5' фосфодиэфирными связями. При ферментативном синтезе применяется фермент полинуклеотидфосфорилаза бактериального происхождения.

Обратная транскрипция. Используют обратную транскриптазу. Матрицей служит мРНК с поли-А 3'-концом, а затравкой является цепочка полидезоксириботимидиновой кислоты с поли-Т концом. Он присоединяется к dA с образованием ДНК и РНК, Вблизи 3'-конца – шпилька – затравка для синтеза второй цепи кДНК (используются ДНКpol 1 и обратная транскриптаза). Шпилька удаляется нуклеазой S1.

Вектор – это специально сконструированная молекула, содержащая регуляторные участки и другие элементы, необходимые для переноса, реализации и поддержания генетической информации в рецепиентной клетке.

Плазмида – кольцевая молекула ДНК, стабильно передающаяся потомству бактериальной клетки независимо от хромосом. PBR 322 – гены устойсивости к тетрациклину и ампициллину. В один из этих генов встраивают нужную информацию и отбирают по устойчивости к определённому антибиотику.

Фаги – содержат линейную ДНК. Способен нести фрагмент ДНК 6000 – 10000 п.н. Левая область ответственна за синтез структурных единиц, средняя – за лизогенный путь развития, правая – содержит сайт инициации репликации, гены, кодирующие ферменты репликации.

Космида – молекула ДНК, несущая плазмидный репликатор, уникальные сайты рестрикции, ген-маркер, cos-сайт фага.

Фазмида – это линейная двуцепочечная молекула ДНК, в которой объединены участки генома фага , ответственные за литическое развитие с линеаризованной плазмидной ДНК.

Идентификация. Складывается из: 1) Отбор трансформированных клеток по гену-маркеру используемого вектора. 2) Обнаружение клеток не только несущих ген, но и синтезирующих продукт. Предложено 2 группы методов. 1-я группа основана на прямом анализе ДНК или секвенировании: 1-й метод Максама-Гилберта. Используются химическая модификация нуклеотидов с последующим расщеплением по модифицированным остаткам. Вводится радиоактивная метка, делится на 4 порции и в каждую вводится химический реагент, модифицирующий только один тип нуклеотидов, затем производится расщепление по модифицированным остаткам. Полученные фрагменты ДНК наносят на пластинку с полиакриламидным гелем. Под действием электрического тока фрагменты движутся от + к - , затем делают рентгенограмму и определяют последовательность. 2-я группа. Методы основаны на идентификации продукта гена. Если встраиваемый ген кодирует человеческий белок, то по иммунной реакции. -галактозидаза, то клетки отбирают на среде с субстратом этого фермента (лактозой). 3-я группа. Если встраиваемый ген кодирует фактор роста – клетки отбирают культивируя совместно с ауксотрофными мутантами.

13 Векторы и ферменты, используемые для создания рекомбинантных ДНК.Для конструирования рекомб-ых ДНК используется множество различных ферментов. В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами. В генетической инженерии используют эндонуклеазы рестрикции рестриктазы. Эти ферменты распознают в молекулах ДНК опреде ленные нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или ше сти остатков и поэтому расщепляют эту кислоту на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. coli, введенная в клетки другого штамма , не проявляет, как правило, генетической актив ности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты. В 1966 г. установлено, что это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК: она содержит несколько метилированных оснований, отсутствующих в немодифицироваиной ДНК, причем метилиро вание (добавление к основанию метилыюй группы СН3) происхо дит уже после завершения репликации. Каждый фермент узнает опреде ленную 4 7-членную последовательность в двухцепочечной ДНК. Разрезание последней по этим сайтам приводит к образованию либо тупых , либо липких, т. е. перекрывающихся концов. Для конструирова ния гибридных молекул особенно удобны последние.Рестриктазы бывают мелко- и крупнощепящими. Первые узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем вторые, распознающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем из шести. Например, в ДНК бактериофага 17, состоящей из 40 000 пар оснований, отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой RI из Е. coli. Рестриктазы по-разному расщепляют ДНК: одни вно сят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, а дру гие со сдвигом с образованием "ступеньки". В первом случае обра зуются так называемые тупые концы, а во втором липкие, т. е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплемен тарные участки длиной в четыре нуклеотида. Последние удобны для создания рекомбинантных ДНК. Для создания рекомбинантных ДНК используют также РНК-за-висимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы, ревертазы), син тезирующие ДНК на матрице мРНК. Применяются и ферменты, со единяющие концы фрагментов ДНК, т. е. ДНК-лигазы. Векторы используемые для создания р ДНК: 1)векторы на основе плазмид. Плазмида- это автономные самореплицирующиеся генетиче ские единицы (ДНК-содержащие), найденные у бактерий, грибов, рас тений и животных. Наибольшее примене ние в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, осо бенно образованные Е. coli. Так, последняя дает ColEl, ColEl Amp (несет ген устойчивости к ампициллину), pBR322 (песет гены устой чивости к ампициллину и тетрациклину), pBR325 (несет гены устой чивости к ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу). 2)векторы на основе фагов. Фаг X умеренный фаг, паразитирующий на клетках Е. coli, содержащий ДНК. Размер последней составляет 45 тыс. пар нуклеотидов, включающих три группы генов и срединную область, которая несет информацию о белке-репрессоре, а также участок для встраи вания ДНК фага в ДНК бактерии. По обе стороны от срединной области располагаются предранние гены, за ними задержанноранние, далее поздние гены, заканчивающиеся двумя cos-участками, функция первых поддержание лизогеппого состояния бактерио фага в клетке. Поздние гены синтезируют фаговые белки, лизирующие клетки и способствующие выходу из бактериальной клетки. Не посредственно cos-участки отвечают за упаковку фаговой ДНК в бел ки. 3)гибридные векторы. В 1978 г. был описан новый вид векторных молекул, получивших название "космиды". Это гибридные векторы, в состав которых вхо дят три компонента: участок плазмиды, включающий ген устойчиво сти к антибиотику и ориджин; cos-участок фага X; рекомбинантиая ДНК. Наличие в составе космид cos-участка позволяет производить упаковку ДНК в головку фага и использовать механизмы последнего для трансформации клеток. Емкость космидных векторов от 33 до 49 тыс. пар нуклеотидов. Фазмидами называют гибриды фагов и плазмид, способные развиваться и как первые, и как вторые. Фазми-ды создаются на основе фага Р1

17. Гибридомные технологии моноклональных антител. (а/т)

Отн к клет инженерии жив. Разраб в 1975 г. Мильштейн и Келлер. Сначала работал с опухолевыми кл (миеломными), получ гибриды миеломных кл или гибридомы, показ, что они продуц-ся иммуноглоб обоих родит форм. Это привело на мысль сливать миелом кл и антителапродуцир-е. В 1974г получ гибрид миел кл и лимфоц селезенки мыши иммуниз-ные эритроцитами барана. Получ гибрид продуц. а/т против этих эритроц.

Получ. МКА. Подоп животные иммун-ют антигеном(а/г), против к-х хотят получ а/т. Напр. берут поверхн белки вир НВs. А/г ввод внутрибрушинно до 200 мкг на 1 кг веса, ч/з 2 нед 100 мкг и ч/з 3 дня у мыши удал. селез, раздел ее кл. Затем их помещ на пит ср, центриф и отбир отдельно В-лимфоциты. Пар-но с кл селез получ мутантную миелом линию, у них блокирован обходной путь биосинтеза НК. Далее проводят слияние получ миелом кл и В-лимф в присут ПЭГ, Са²⁺, 4⁰С. Гибриды В-лимф, отдельн миел кл и гибриды В-лимфоц и миеломы. Далее кл помещ на пит ср с добавл в-ва аминоптерина( блокирует пямой путь биос-за НК). Погибают гибриды миелом, В-лимф, негибри-домные кл и выжив только гибриды В-лимфоц и миеломы. Отбир те из них, к-е дают а/т. В лунке иммуноклональной планшеты вносят пит ср и разводят так, чтобы в кажд лунку попало по одной кл. После размнож кл в лунке провер их на образ а/т – добавл а/г. Содержимое лунки переносят в колбу, затем в ферментер и получ требуемое нам в-во. Полученные т.о. а/т носят назв МКА.

Колич-ое опред различ в-в. (ИФА, ИРА, ИфиА). Базир-ся на сендвич методе. На твердом носителе прикреп а/т первой специфичности. Ч/з носитель пропускают исследуемый р-ор. Если в р-ре присутствуют исследуемые в-ва, то они связ-ся с а/т и для его идентификации добавл а/т 2 с меткой. Служат для обнаружения инфекц забол, диагн ссс, диабета, рака,

Аутоиммунных забол, контроль за уровнем гормонов, для обнар наркотиков, допингов в крови, установл беременности на ранних сроках. В животноводстве исп-ся для опред инфекц забол и фертиль ности (плодовитости). Сравн конц-цию прогестерона в теч овуляционного цикла. Во время овуляции мала, затем возраст до max. (в крови и молоке пар-но).

Если животное стерильно, то конц постоянно высока. В растен-ве для определ вир забол. В 1982г анг учен Фарандс обнар а/г на опухолевой кл (Cal-Ag), а затем а/т. К Cal-Aт пришив I и ввод в орг пациента. Ч/з нек время проводят рентгенограмму и по ней опред истинное положение опухоли и ее метостазы. Терапия. К Cal-Aт пришив токсин (растит токсин – рицин из семян клещев, дифтерийн токсин, α-амоницин из яда бледной поганки), состоящий из двух субъединиц А и В, В отвеч за связывание с углеводами на мемб-не, а А яв-ся токсичной частью. Исп-ют А часть. Лечат рак толстой и прямой кишки.

16.Основы культивирования продуцентов

Периодическое культивирование микроорганизмов – метод культивирование микроорганизмов, характеризующийся однократным засевом среды в начале и одноразовым получением биомассы в конце процесса, обычно после полного использования субстрата.

Периодическое культивирование микроорганизмов может быть представлено статическими, динамическими и продленными способами культивирования. Статические процессы осуществляются в стационарных условиях без перемешивания. При этом аэробные микроорганизмы обычно развиваются на поверхности жидкой или твердой среды (поверхностное культивирование), например, поверхностный способ жидкофазного культивирования Aspergillus niger для получения лимонной кислоты.

Периодические динамические процессы осуществляются с помощью перемешивания и аэрации: в жидких средах на качалках, в биореакторах при помощи мешалки и барботера.

Твердофазное культивирование (ТФК) – это выращивание микроорганизмов в массе измельченного влажного твердого субстрата. Технологическими вариантами ТФК являются компостная куча, поверхностное культивирование, перемешиваемый слой, культивирование во вращающихся ферментерах, ТФК с перемешиванием и аэрацией и т.д.

К продленным способам культивирования относятся:

1. отъемно-доливной способ, когда порциями в аппарат подается среда и производится отъем культуральной жидкости;

2. периодическое культивирование с подпиткой, когда в культуральную жидкость добавляется по специальной программе отдельные компоненты питательной среды и периодически отбирается часть культуральной жидкости;

3. диализное культивирование в гильзе, не проницаемой для клеток, но пропускающие растворенные вещества;

4. батарейный способ, когда микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментеров.

18 Безопасные вирусные вакцины.

Препараты, полученные из бактерий, вирусов и других м/о или из их продуктов жизнедеятельности, применяемые для активации иммунитета у людей и животных, в первую очередь для профилактики конкретных инфекций. Классификация 1)вакцины, полученные от эу- и прокариот (живых и убитых); 2) из клеточных компонентов; 3) из продуктов обмена клетки; 4) вирусные: живые, инактивированные, из вирионов; 5) геномные. Живые вакцины – аттенюированные (ослабленные) получают по схеме: выращивание в ферментёре → сепарирование → ресуспендирование (смесь:желатин+сахароза, вода)→розлив во флаконы. Ослабляют нагреванием или обработкой формалином. Иммуногенность или способность образовывать антитела(АТ) от наличия на поверхности белка эпитопов, состоящих из 6-8 аминокислотных остатков. Поколения вакцин: 1 поколение: субъединичные-полноразмерные с несколькими типами эпитопов вызывают образование нескольких видов АТ; 2 поколение: на основе эпитопов. Эпитоп прикрепляют к белковому носителю, потому что он очень мал и может уничтожится в организме. Эти вакцины не вызывают заболевания, не несут генетической информации, вызывают тот же спектр реакций, что и нативные вирусы. Можно получить генно-инженерным методом; 3 поколение-на основании консервативных эпитопов. Они есть у всех вирусов, в нативных условиях себя не проявляют; 4 поколение-живые аттенюированные возбудители. Из вирусов удаляют часть генов, остаются только необходимые для размножения. Вызывают иммунный ответ, а заболевания не вызывают. Вакцины против гепатита В: вирус вызывает болезнь печени (вирус передаётся через кровь и половым путём). В плазме крови присутствует в виде сферических или нитевидных частиц; лишён ДНК; полноразмерный вирион содержит ДНК. ДНК данного вируса двухцепочечная. 1 цепь длинная и фиксированная, другая короткая с изменяющейся длиной, которая определяет подтипы. Вакцины против вируса гриппа. Вирус имеет липотропную оболочку. Главным белком является гемоглютинин. Было обнаружено 4 эпитопа (2 снаружи-А и В, 2 внутри мембраны-С и D). Их клонирование в E. coli приводит к образованию гемоглютинина. Вакцины против ВИЧ. Это РНК содержащие вирусы. РНК двухцепочечная, покрыта капсулой и липотропной оболочкой с шипами белков GP 120 и GP 41. Белок GP 120 в составе ретровирусного вектора встраивают в макрофаг. Иммунная система воспринимает этот макрофаг как чужеродное тело и уничтожает его.

19Пропионово-кислое брожение (п/к/б).Химизм брожения. П/к/б – это метаболический процесс в результате, которого образуется пропионовая кислота, а клетки получают энергию.Особенность этого брожения - карбоксилирование пирувата, приводящее к образованию нового акцептора H₂ щавелево-уксусной кислотыТеоретически п/к/б приводит к образованию 4-х молекул АТФ при сбраживании 1,5 молекул глюкозы.

Глюкоза→пируват СН₃-СО-СООН→ СН₃-СО-Ко-а → СН₃ СООН (уксус.кис)

Из пирувата СН₃-СО-СООН→цикл Кребса образуется пропионовая кислота.

Возбудителями п/к/б явл. пропионовые бактерии, которые относятся к роду Propionibacterium – это 2-я категория 20 группа по Берджи, грамм+ палочки неправильной фориы, необразующие споры.Эти бактерии были выделены из сыров в 1878 г. Пропионовые бактерии можно разделить на кожные (обитают на кожных покровах человека) и классические (в кишечном тракте жвачных животных). t роста кожных 37 ^оС, у классических 28-32 ^оС. Пропионовые бактерии предпочитают анабиоз, но в присутствии кислорода они не погибают.У пропионовых бактерий можно выделить 2 особенности: 1) усовершенствование основного анаэробного способа получения энергии 2) рациональное использование молекулы O₂.

Пропионово-кис­лые бактерии давно уже используются при изготовлении твердых сы­чужных сыров с высокой температурой (55 — 58 °С) второго нагре­вания. К таким относятся сыры сортов «Советский», «Швейцарский», «Бийский», «Алтайский». В их созревании кроме P. shermanii уча­ствуют также Streptococcus thermophilus, Lactobacterium helveticum, L. lactis. Молочио-кислые бактерии превращают лактозу в лактат, осу­ществляют протеолиз казеина, образуют ароматические вещества. Про-лионовые бактерии из лактозы и лактата синтезируют пропионовую, ксусную кислоты и выделяют углекислоту, которая в значительной степени обусловливает рисунок сыра.

Пропионовым бактериям присуща высокая липолитическая ак-вность, способствующая образованию жирных кислот: пропионовой, хусной, миристиновой, пальмитиновой, стеариновой и олеиновой. Все л способствуют созданию аромата сыра.

20 АЦЕТОНО-БУТИЛОВ БРАЖЕНИЕА/б/б – это брожение масляно-кислого типа, брожение приводит к образованию различных продуктов, но масляная кислота появляется всегда либо как конечный продукт, либо как промежуточное соединение при образовании бутанола. Бутиловый спирт — продукт брожения некоторых разновидностей масляно-кис-лых бактерий — обнаружен Л. Пастером в 1862 г. Несколько позднее Бейеринк выделил палочковидную бактерию, сбраживающую глице­рин с образованием в числе продуктов брожения бутилового спирта. Более подробно вопросом получения в результате брожения бутаиола занимались Фитц и Бухнер, а Шардингер (1905) установил, что неко­торые бактерии при росте на средах с углеводами накапливают аце­тон. Но все эти исследования сначала представляли чисто теоретиче­ский интерес. Положение, однако, изменилось в 1909 г., когда бутило­вым спиртом заинтересовались как возможным исходным продуктом для синтеза каучука (через бутадиен). Первый ацетоиобутиловый за­вод был построен в Англии в 1914 г.

В период Первой мировой войны еще большее значение приобрел ацетон, необходимый для приготовления взрывчатых веществ. Про­дукты брожения применяются для нужд иитроцеллюлозиой и лако­красочной промышленности, производства фотопленок, ацетилцеллю-лозы, органического стекла и других отраслей химической и фарма­цевтической промышленности.

Промышленное получение в СССР бутилового спирта и ацетона путем брожения явилось результатом работ коллектива ученых, руко­водимого Шапошниковым. Проведенные ими исследования позволи­ли в 1935 г. наладить производство этих продуктов микробиологиче­ским способом.

Бактерии, образующие в процессе своей жизнедеятельности в зна­чительном количестве ацетон и бутиловый спирт, широко распростра­нены в природе. Они находятся в основном в почве, откуда могут быть довольно легко выделены в виде чистых культур. Относятся к роду Clostridium, который включает большое число видов. Из различных клостридиев

способных к образованию в процессе брожения бутано­ла и ацетона, наиболее активным их продуцентом признан Clostridium acetobutylicum, применяемый для производства этих растворителей.

Рост культур происходит только в анаэробных условиях на до­вольно простых средах, содержащих различные углеводы. Кроме них С. acetobutylicum может сбраживать глицерин, маииит, глюконат, пи-руват и некоторые другие вещества. Нуждается в таких витаминах, как биотип и парааминобензойная кислота. Бактерия способна к фик­сации молекулярного азота. Наиболее подходящая температура для роста — 37 — 38 °С, оптимальное значение рН среды — 5,1 — 6,9.

Благодаря наличию амилолитических ферментов бактерия исполь­зует крахмал. Выделяет в среду протеиназы, в результате чего спо­собна разлагать белки. Поэтому С. acetobutylicum относят к группе Протеолитических клостридиев.