заочка / 14_15

14 Генно-инженерные работы с растениями

Существует два способа обеспечения растений азотнмм питанием de novo; биологический (фиксация молекулярного азота живыми организмами) и химический (внесение азотных удобрений). Биологическую фиксацию осуществляют в основном симбиотические микроорганизмы, В настоящее время известны четыре главные системы симбиоза: Rhizobia - бобовые, Azolla-Anabaena - рис, Actinomyces - деревья, Spirillum - травы.

Из всех известных в настоящее время азотфиксаторов лучше всего изучены ризобии, У них гены, вовлеченные в процесс азотфиксации, обозначаются индексами nif и fix. nif-гены кодируют ферменты и факторы нитрогеназного комплекса, fix-гены -все остальные гены, продукты которых участвуют в азотфиксации, Кроме того, большое значение имеют гены syin— определяют симбиоз между растением и ризобиями и формирование клубеньков. Установлено существование hsn-генов - определяют видовую специфичность взаимодействия ризобии с данным видом бобовых; и enf—генов — повышают эффективность образования клубеньков. Есть и др. гены, однако они еще мало изучены.

1.1. Гены азотфиксации них регуля ция.

Область nif-генов состоит, из 17 генов, организованных в 8 единиц транскрипции (оперонов). Два регуляторных гена А и L сгруппированы в одном опероне и, кодируют белки, определяющие экспрессию всех других nif-оперонов.

Продукт nif А-гена - р-фактор РНК-полимеразы - активатор транскрипции всех других генов, а продукт nif L-гена подавляет транскрипцию всех др. генов при наличии в клетках большого количества доступного азота, а также при высокой концентрации кислорода.

1.2. Генно-инженерные работы в обл. биол. фиксации N2. Основная часть генов nif-области является высоко консервативной. При трансгенозе в другие виды бактерий продукты этих генов легко "вписываются" в метаболизм гетерологического хозяина. Так, в рекомбинантной E.coli (родственной азотфиксаторам) в анаэробных условиях имела место нормальная экспрессия nif—генов и успешная азотфиксация. Наряду с трансгенозом nif-генов в бактерии разрабатывается генно-инженерный проект по переносу nif-функций в высшие растения, чтобы обеспечить связывание азота непосредственно в растительных тканях, независимо от наличия особых симбиотических организмов.

Симбиотические отношения между ризобиями и их естественными бобовыми партнерами определяются сложной системой sim-генов. Перенос этих генов клеткам Agrobacterium tumefaciens (способны инфицировать широкий круг двудольных растений) привели к формированию клубеньков, но в таких клубеньках отсутствовали некоторые структуры, бактероиды, не было азотфиксации. генно-инженерной задачей доступной для решения в ближайшем будущем станет повышение эффективности существующих систем азотфиксации с помощью известных приемов, 

Существует генно-инженерный проект, рассчитанный на создание ре-комбинантных растений злаков либо с амплифицированными генами белков зерна богатых лизином, либо с генами этих белков, подстроенных под более сильные промоторы. Второй путь увеличения свободного лизина в зерне предполагает химический синтез генов, которые программируют неприродные полипептиды, построенные в основном из незаменимых аминокислот. Был получен ген НБНА кодирующий белок с высоким содержанием лизина. Этот белок легко деградировался в организме животных. Этот ген был встроен в плазмидную конструкцию, созданную на основе плазмид Agrobactericum rhisogenes и A. tumefaciens. В качестве селективного гена был использован ген антибиотико-резистентности. Удалось трансформи­ровать клетки растений табака этими рекомбинантнымм,плазмидами и регенерировать химерные растения, в которых ген НБНА экспрессировался. программируя синтез искусственного белка.

4. Генно-инженерные работы по созданию растений, устойчивых к ранним заморозкам.

под устойчивостью (чувствительностью) растения к заморозкам понимают способность (неспособность) противостоять механическим повреждениям их тканей кристаллами образующимися при низкой температуре льда.

Существенный фактор повреждения многих растений ранними заморозками - сапрофитная микрофлора, главным образом представители, родов Pseudomonas, Erwinia, Xantomonas и др. Клетки данных микроорганизмов способны синтезировать определенный белок формирования кристалов льда, локачизующийся во внешней мембране этих бактерий и являющийся превосходным центром кристаллизации льда уже при температурах -1,5 - 1,8°С. Стерильные же растения не повреждаются заморозками вплоть до температур порядка -6-8°С.

В основе генно-инженерного подхода к борьбе с повреждающим действием ранних заморозков лежит тот Факт, что БФКЛ мутанты Ps. syringae.n Ps. fluorescens как природные, так и экспериментально полученные, теряют способность повреждать сельскохозяйственные растения (цитрусовые, тома­ты, картофель) при низких температурах. Поэтому возникла идея получить стабильные БФКЛ мутанты названных бактерий, неспособные к реверсии к дикому типу, и вытеснить с их помощью природную микрофлору, синтезирующую БФКЛ.

5. Генно-инженерные работы по созданию растений, устойчивых к гербицидам.

Недостаток многих гербицидов - способность воздействовать не только на сорняки, но также подавлять и многие основанных на увеличении дозы гена, усилении транскрипции генов, продукты которых образуют узкое место в каскадном механизме азотфиксации, путем введения более сильных промоторов,

2. Генно-инженерные работы в области повышения эффективности фотосинтеза.

Фотосинтез, осуществляемый растениями, характеризуется в целом весьма низкой эффективностью, т.к. фотосинтетический аппарат использует лишь 3—4% падающего света.

переключение С3-пути фотосинтеза (злаковые) на С4-путь (кукуруза), который более эффективный, путем трансгеноза группы генов.

Первый этап представляет собой карбоксилирование, которое у Сз-растений происходит путем взаимодействия свободного углекислого газа с основным доступным акцептором - рибулозо-1,5-6ифосфатом, в результате чего образуется две молекулы 3-фосфоглицерата:

СО2 Н2О

С5  С6  С3+С3,

Реакция катализируется карбоксилазой рибулозо-1,5-бифосфата (РБК). которая локализована на обращенной к строме поверхности мембран тила-коидов. Эта реакция - лимитирующая стадия в функционировании цикла Кальвина. У растений и фототрофов на свету идет ускорение этой стадии.

Второй стадией цикла у С3-растений является восстановление 3-фосфоглицерата за счет энергии фотореакции до триозофосфата. На первой стадии у С4-растений акцептором СО2 выступает фосфоенолпируват, который в результате реакции карбоксилирования превращается в оксалоацетат, последний далее в малат и аспартат: СО2

С3  С4

Реакция осуществляется ферментом - фосфоенолпируват-карбоксилазов (ФЕПК). ФЕПК и субстрат расположены клетках, соприкасающихся с воздухом, а образовавшиеся C4 соединения транспортируются в клетки которые служат основным местом локализации фотосинтетической системы Здесь образовавшиеся С4 соединения подвергаются декарбоксилированию, в результате чего создается высокая концентрация CO2, вступающего в цикл Кальвина. Эффективность фотосинтеза у С4-

растений повышается

Основное внимание в генно-инженерных проектах уделяется механизму повышения концентраций СО2 и повышению сродства РБК к СО2. Более простой задачей явился бы перенос генов ФЕПК и декар-боксилазы в Сз-растения, не элиминирующий при этом собственные РБК Сз—типа3. Генно-инженерные работы в области увеличения содержания незаменимых аминокислот.

Улучшение качества зерна основных злаковых культур, прежде всего изменение аминокислотного состава запасных белков. в запасном белке большей части злаковых имеется дефицит лизина и в меньшей степени треонина, что заметно снижает их пищевую и кормовую ценность

культурные растения. К числу таковых относится глифосат, который подавляет синтез ряда важнейших аминокислот и поэтому убивает не только сорняки, но и культурные виды растений,.

Применение гербицидо-устойчивых растений позволит существенно видоизменить тактику борьбы с сорняками,

В настоящее время обнаружено большое количество ферментов, разрушающих те или иные гербициды. Целый ряд ферментов получен в очищенном виде, для ряда из них клонированы индивидуальные гены. Введение таких генов в растения, чувствительные к гербицидам, может обеспечить возникновение устойчивости при адекватной экспрессии в нужном клеточном компартменте

15 Генетическая инженерия с/х животных

Для трансформации используют прямые методы и методы с использованием векторов. Прямые методы: 1) микроинъекция-клетку фиксируют в микроманипуляторе, делают укол либо в цитоплазму либо в ядро ( в зависимости от того, что кодирует ген). Ген может встраиваться в хромосому или существовать сам по себе. 2) слияние протопластов-в суспензию отдельных клеток вводят чужеродную ДНК и ионы кальция, т.к. ДНК имеет фосфорные группировки кальций связывается с ними и выпадает в осадок. Он оседает на клетке и попадает внутрь. Используют крупные фрагменты ДНК или отдельные хромосомы. 3) ДЭАЭ-декстрановый метод- ДЭАЭ-декстран используют или переносчик при облегчённой диффузии. Он захватывает ДНК на клеточной поверхности и переносит через мембрану. Чаще используют для половых клеток, реже для зиготы. Для трансформации многоклеточного зародыша используют векторные методы: Используют 1) ретровирусы на основе лейкоза мышей. Это РНК-содержащий вирус. При попадании в клетку на РНК строится ДНК-копия, которая встраивается в геном. И этот геном реплицируется животной клеткой. Векторы на основе 2) летальных вирусов, вирус SV-40 – это ДНК содержащий вирус, в него встраивают чужеродный ген. 3) Челночные векторы – работают и в бактериях и в клетках животных. Для животных он был сконструирован из ДНК вируса, вызывающего доброкачественную опухоль; из плазмиды PBR 322. В случае использования методов прямого переноса получают полностью трансгенное животное (каждая клетка несёт чужеродный ген, однако не во всех животных он работает, т.к. может попасть в область молчащих генов. Если трансформации подвергается многоклеточный зародыш, то получают частично трансгенное животное.

Гормон роста – соматотропин: синтезируется передней долей гипофиза, стимулирует рост скелета и мышц, воздействует на обмен углеводов и липидов. Было предположено использовать его для ускорения роста и увеличения массы с\х животных. Но эти препараты нужно было вводить ежедневно. Свиньям вводили ген гормона роста КРС, при этом ускорялся рост и происходило увеличение мышечной массы. Свиньи потребляли такое же количество корма, но усваивали его эффективнее. Но есть и минусы этого метода: многие свиньи оказывались стерильными, у других возникал сахарный диабет, у некоторых были хрупкие кости.

Белки молока – важный белок-казеин. Цель работ-увеличить его содержание в молоке. Встраивали дополнительные копии гена, отвечающего за синтез казеина и некоторых животных удалось получить молоко с повышенным содержанием белка. Другая проблема – обсеменённость и подверженность к скисанию. Животным встраивали ген, ответственный за синтез фермента лизоцима, который повреждал бактериальные клетки и молоко долго хранилось. Присутствие молочного сахара – встраивали ген, ответственный за синтез галактозидазы, в результате получали (животные давали) безлактозное молоко.

Предприняты попытки по получению молока с физиологически-активными веществами. Удалось получить интерлейкины, фактор некроза опухолей, фактор свёртывания крови VIII, ингибиторы протеолитических ферментов.

Увеличение выхода и качества шерсти овец – лимитирующим фактором являются серосодержащие аминокислоты. Чем их больше в рационе и чем их больше синтезируется в рубце, тем больше выход шерсти и выше качество. Увеличение числа и активности оперонов биосинтеза серосодержащих аминокислот.