заочка / bilizatsii_biokatalizatorov
.doc31 Методы иммобилизации биокатализаторов.
Иммобилизация – перевод фермента в фиксированное на или в носителе состояние с сохранением max возможной каталитической активности. Для иммобилизации ферментов используют органические и неорганические носители, к ним предъявляют следующие требования: 1) высокая химическая и биологическая стойкость, 2) высокая механическая прочность, 3) достаточная удельная поверхность, пористость, вместимость, 4) возможность получения в удобных формах (гранул, мембран), 5) доступность и дешевизна, 6) возможность быстрой активации, 7) гидрофильность (не всегда). Органические делят на природные и синтетические. Природные дорогие, многие не устойчивы при высокой температуре, не устойчивы к м/о. Это полисахариды и белки. Полисахариды: целлюлоза, декстран, агароза, агар-агар, альгиновые кислоты и их соли, альгинаты, крахмал, каррагинаны. Белки: кератин, фибрин, миозин, коллаген, сывороточный альбумин. Синтетические – полимеры на основе акриловой кислоты: акриламид, используют ПААГ (полиакриламидный гель) (получают при сополимеризации акриламида со сшивкой – N,N,N-метилен-бис-акриламидом); носители на основе поливинилового спирта; полиуретановые носители. Для того, чтобы носитель мог удержать фермент, его переводят в активное состояние, т.е. проводят химическую реакцию, в результате которой на поверхности носителя образуются функциональные группы. Иногда используют для иммобилизации фосфолипиды. Неорганические носители: макропористые стёкла, силикагель, кремнезёмы.
Физическая иммобилизация – без образования химической связи. Адсорбционная иммобилизация–фермент удерживается на пов-сти носителя с помощью электростатических или водородных связей.Статический способ–носитель вносят в забуференный раствор фермента и оставляют без перемешивания.Идёт адсорбция ф-та на пов-сти носителя,процесс длительный. Способ с перемешиванием – также + перемешивание и удаляют буферную жидкость центрифугированием.Метод электроосаждения – фермент имеет заряженные группировки на поверхности. В раствор фермента погружают электроды, на поверхность одного из них – слой носителя, при пропускании электрического тока будет идти осаждение фермента на носитель. Иммобилизация с использованием двухфазных систем. Фермент растворяется в одной из фаз двухфазной системы. Субстрат и продукт распределены между несмешивающимися жидкостями (продукт оказывается в той фазе, где нет фермента, а субстрат находится в фазе с ферментом). После окончания процесса фазу с продуктом отделяют и выделяют сам продукт, а фазу с ферментом используют вновь. Используют воду (в ней фермент) и органический неполярный растворитель (в нём продукт).
Химические методы – образуются химические связи между мол-ми фермента и носителя. Существует 3 варианта: 1) фермент присоединяется непосредственно к носителю, 2) фермент присоединяется к носителю через сшивку (сшивка – посредник) (этот способ применяют, когда непосредственный контакт фермента с носителем нежелателен), 3) к ферменту присоединяется много бифункциональных сшивок, к ним в свою очередь присоединяются другие молекулы фермента с множеством сшивок по поверхности, таким образом образуются агрегаты сетчатой структуры (трёхмерная сеть) (фермент выступает одновременно и в качестве носителя).
Природа адсорбц взаимод-й. Адсорбция идёт за счёт Ван-Дер-Вальсовых сил, электростатических, водородных, гидрофобных. Диаметр пор должен быть в 2 раза больше, чем диаметр молекул фермента. Если носитель не является ионообменником, то иммобилизация идёт в изоэлектрической точке белка. Концентрация фермента – до насыщения, т.к. носитель имеет определённое количество центров связывания. t может усиливать адсорбцию, но с другой стороны ведёт к денатурации. Включение в гель – чаще всего иммобилизуют живые клетки, т.к. гель представляет собой систему открытых пор, через которые идёт обмен газами, поступают питательные в-ва и удаляются продукты метаболизма. Для проведения иммобилизации готовят смесь из следующих компонентов: фермент, мономер, сшивающий агент. Инициаторами иммобилизации являются радикалы, которые образуются в результате окислительно-восстановительных реакций или фотохимических реакций. Чаще используют окислительно-восстановительную пару: персульфат калия и аммония и тетраэтил-мэтилен-диамид. Процесс ведут при пониженных температурах. Полисахариды могут образовать гели при охлаждении их горячих водных растворов. Фермент добавляют перед началом гелеобразования.
Иммобилизация с использованием мембран – микрокапсулирование – иммобилизуется раствор, содержащий фермент, а не отдельные молекулы или клетки. Суть метода – водный раствор фермента включают внутрь микрокапсул, которые представляют собой замкнутые сферические пузырьки. Этапы этой иммобилизации: 1) готовят раствор фермента, 2) готовят органическую фазу, содержащую ПАВ, 3) смешивают их, 4) добавляют органический растворитель и образуются микрокапсулы, 5) выделяют микрокапсулы осаждением.
Включение в мембраны и волокна. В этом случае образуются нити. Эмульсиюводного р-ра фермента в органич растворе волокнообразующего полимера продавливают через прядильное устройство в коагулирующую жид-ть, получ-ся волокна, кот представляют собой пористые полимерные гели в кот находится фермент.