30 Кинетика ферментативных реакций.

Ферм-ая кинетика осн-ся на хим кинетике и учении о равновесии.

Вследствии спец св-в ферментов Е они несколько видоизм-ся А+В=С, ν = - ∆А / ∆t = - ∆В / ∆t = + ∆С / ∆t = - ∆S / ∆t Чтобы знать скорость ферм реакции нужно знать ∆S за малый промеж времени. Это можно опр-ть в интервале, где завис-ть между измен-ем конц S и временем линейная. Это начальн скорость р-ции. Согласно хим кинетике, скорость р-ции при пост t пропорц произведению конц реагир в-в взятой в положит степени. nA + mB = cP. ν = k [A]ⁿ [B]^m Если [A]= [B]=!, то ν = k. Следов-но const скорости р-ции при конц реагир в-в = 1, т.е. она не зависит от конц реаг в-в. Анри и Браун высказали мысль о том, что ферм р-ции идут за счет вз-ия Е с субстратом S с обр-ем комплекса, в рез-те кот обр-ся Р-m и высвоб-ся Е-m. [E] + [S]  [ES]  [P] + [E] В первой р-ции устан-ся равновесие и оно наруш-ся высвобожд-ем Е из комплекса [ESo] в направлении k₊₂.

k_S = 1/ k_P = [E] [S] / [ES] – const распада [ES] (1)

Скорость р-ции по Sт = скорости по обр-ю Р если будут выполн след усл: [S_o]>>[E_o].

ν = - dS / dt = +dP / dt =k₊₂ [ES] (3)

Если остановить р-цию, то весь Е будет в 2 сост:

Е_о = [E]+ [ES]? [E] = [ES] – кол-во соед-го Е. (2)

Из (1) получаем: [ES] = [E_o] [S] / k_S; подставляем (2) [ES] = ([E_o][S] – [ES][S]) / k_S,

[ES] = [E_o][S] / (k_S + [S]) (4)

Из ур-я (3) и (4) получаем:

ν =k₊₂ E_o S / (k_S + [S]) – ур-е Михаелиса-Ментен

«-» не учитывается, вторая часть ферм-ой р-ции. Стандартное состояние – распад [ES] в направлении –1 +2 уравнов-ся его образ-ем в направлении k+1.

K₊₁ [E][S] = k_—1 [ES] + k₊₂ [ES].

ν =k₊₂ E_o S_o / (k_m + [S]) – ур-е Холдейна-Бригса.

Оно хорошо описывает экспер-ые данные по кинетике У-ых р-ций. Чаще его применяют в дифференц форме, т.е. находят ν_о по начальной конц S и исходной конц Е.

ν_о = k₊₂ E_o S_о / (k_м + [S_о]).

В ходе р-ции могут появл-ся дополнит эффекты тормозящие процесс р-ции и они могут искажать ход процесса.

1) при малых концS когда k_m > [S_o]

ν_о = k₊₂ E_o / k_м . 2) если конц S большая S_o >> k_m, то ν_о = k₊₂ E_o – max ν = ν_m, 3) если k_m = S_o, то ν_о = ½ ν_m

k_m показывает сродство Е к S или меру насыщения фермента субстратом.

32 Кинетика катализа иммобил. Ферментов.

V=V_m*S/(K_m+S) – уравнение Холдейна-Бригс, где V_m=К_kat*E₀(К_kat-каталитическая постоянная ферментативной реакции); K_m характеризует сродство фермента к субстрату. Это справедливо, когда концентрация субстрата во всей системе одинакова. Если используют готовый иммобилизованный фермент то концентрация субстрата вблизи носителя отличается от концентрации в растворе и тогда К_m зависит от этого распределения и уравненеие имеет вид V=(K_kat*E₀*S)/ (K_m^иф+S). К_kat – не зависит от распределения и характеризует реакционную способность образующегося фермент-субстратного комплекса. При иммобилизации пространственная структура фермента может изменится. Это может быть вызвано разными причинами: 1) модификация функциональных групп белка, ответственных за превращение субстрата 2) неспецифичные взаимодействия фермента с носителем могут привести к денатурации фермента. K_m^иф=K_m*Р, где K_m^иф – кажущаяся константа Михаэлиса для иммобилизаванных ферментов, K_m - константа Михаэлиса для свободного фермента, Р – величина распределения субстрата. Р=[S]_р/[S]_н, где [S]_р – концентрация субстрата в растворе, [S]_н - концентрация субстрата около носителя. Если S>K_m^иф, то V= V_m= K_kat*E; если S<<K_m^иф, то 1) если р>1, то скорость реакции будет уменьшаться 2) если р<1, то скорость реакции будет увеличиваться по сравнению со свободным ферментом. Основная причина неравномерности распределения (р≠1) взаимодействие носителя с субстратом. Для того, чтобы произошла ферментативная реакция субстрат должен достигнуть фермента, который может быть или на поверхности носителя или внутри него. Если реакция идёт быстрее, чем субстрат подходит из раствора, то около носителя образуется зона обеднённая субстратом и скорость реакции определяется скоростью диффузии субстрата к носителю. Если перенос субстрата идёт быстрее, чем реакция, то глубинные области будут обеднены субстратом. К поверхности носителя в ферментом всегда примыкает неперемешиваемый слой жидкости, сквозь которую диффузия субстрата ограничена, следовательно субстрат должен сначала проникнуть через плёнку, а далее образовать фермент-субстратный комплекс. При переводе фермента в иммобилизованное состояние оптимальная рН его может изменится. Если носитель полианионит, то конц-я Н⁺ внутри ↑, а рН↓, чем в растворе если поликатионит, то наоборт. Во втором случае фермент работает менее эффективно. Этого можно избежать используя высококонцентрированные буферные растворы или экранировать заряд ионами. Носитель припятствует свободной диффузии Н⁺ внутрь. Это особенно важно, когда Н⁺ образующийся в результате реакции может накапливаться в носителе и отрицательно влиять на фермент (изменять рН). Если рН до начала реакции была выше оптимальной (внутри носителя), то образующиеся протоны снизят рН и увеличат скорость ферментативной реакции и это приведёт к ещё большему снижению рН. Если рН до начала реакции была ниже оптимальной, то выделение Н⁺ будет замедлять реакцию.

1 свободный фермент

активность 2 слабые диффузионные

ограничения

3 3, 4 усиленные диффузион

4 ные огрничения

2 Участки, соответствующие

1 низким значениям рН

опт рН соврадают, а выше рН_опт шире. Значительные ограничения в диффузии Н⁺ могут привести к плато 3. Носители вносят свою специфику в действие ингибиторов и активаторов. Действие НМ ингибиторов определяется распределением ингибитора между раствором и носителем. Если заряды ингибитора и субстрата одинаковы степень ингибирования уменьшается, если разные – увеличиватеся. Если есть сильные ограничения (диффузионные) для субстрата, то фермент может не реагировать на ингибитор. При слабых диффузионных ограничения ингибитор подавляет фермент. Некоторые ферменты ингибируются ВМС ингибиторами. Здесь играют роль диффузионные ограничения. Ингибирование продуктами: увеличение концентрации продуктов в окружении фермента ингибирует его; при внутри-диффузионном ограничении концентрация продукта увеличивается к центру, и концентрация субстрата уменьшается и ингибирование увеличивается в центре.