Литература / Руководство БХ
.pdfЧерез 1 минуту измеряют исходную величину экстинции при длине волны 340 нм (334 или 365 нм) против воздуха. Повторяют измерение точно через 1, 2 и 3 мин. Вычисляют среднее изменение экстинции за 1 минуту (∆Е/мин).
Если активность ЛДГ в сыворотке превышает 1200 Ед/л, необходимо развести исследуемый материал 0,9 % раствором NaCl в 10 раз и повторить анализ; результат умножают на 10.
Расчет
Расчет активности фермента (Ед/л) проводят по формулам:
Температура исследования |
Температура исследования |
||||
25 0С/30 0С |
|
|
37 0С |
||
Ед/л = 15000 х ∆Е365нм/мин |
Ед/л = 29705 х ∆Е365нм/мин |
||||
Ед/л = 8095 х ∆Е340нм/мин |
Ед/л = 16030 х ∆Е340нм/мин |
||||
Ед/л = 8250 х ∆Е334нм/мин |
Ед/л = 16345 х ∆Е334нм/мин |
||||
Нормальные показатели |
|
|
|
||
Температура ис- |
|
25 0С |
30 0С |
|
37 0С |
следования |
|
|
|
|
|
Ед/л |
|
120-240 |
160-320 |
|
225-450 |
Аналитическая характеристика набора
Линейность – до 1200 Ед/л.
Воспроизводимость – коэффициент вариации не более 5 %.
Активность ЛДГ в сыворотке крови значительно возрастает у больных при инфаркте миокарда, лейкозах, ишемическом поражении почек, гепатите, панкреотите, гемолитической и серповидноклеточной анемии, прогрессирующей мышечной дистрофии, опухолях, что имеет важное диагностическое значение.
Обнаружение гликогена в печени крыс. Гликоген представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде и, подобно белкам, способный высаливаться из раствора солями щелочных и щелочноземельных металлов, спиртами. На долю гликогена в печени приходится до 5 %, при голодании в течение суток почти весь запас гликогена расходуется.
Принцип метода:
Метод основан на том, что гликоген хорошо растворим в воде и достаточно устойчив в слабокислой среде. Выделение гликогена сводится к механическому разрушению ткани и экстракции гликогена 5 % раствором ТХУ (белки при этом денатурируют и легко удаляются фильтрованием).
Ход работы:
В опыте используют печень сытого и голодавшего животных, предварительно обработанную кипящим физраствором для инактивации фермента фосфорилазы.
1.Отвешивают на аптечных весах 0,5 кг печени, помещают в ступку, заливают 3 мл 5 % раствора ТХУ и растирают пестиком в течение 10 мин. Затем к экстракту прибавляют 3 мл дистиллированной воды, суспензию перемешивают и фильтруют через смоченный водой бумажный фильтр в чистую пробирку.
2.С полученными фильтратами выполняют качественные реакции на гликоген.
Берут 4 пробирки, в одну наливают 0,5 мл дистиллированной воды, во все остальные по 0,5 мл фильтрата, полученного из печени сытого животного. В первую и вторую пробирки добавляют по 2 капли раствора Люголя, в третью – 0,5 мл спирта, в четвертую насыпают порошок сульфата аммония до насыщения (т. е. до тех пор, пока на дне пробирки останутся не растворяющиеся кристаллы соли). Наблюдают результат.
Результаты оформляют в виде таблицы:
Препарат |
|
Реактивы |
|
|
|
р-р Люголя |
спирт |
|
сульфат аммония |
Дистиллированная вода |
|
|
|
|
21
Печень сытого животного
Печень голодавшего животного
Выводы
Аэробный обмен углеводов
Катаболизм глюкозы – основной поставщик энергии для процессов жизнедеятельности организма. Аэробный распад глюкозы включает несколько стадий:
1.процесс окисления глюкозы с образованием 2 молекул пирувата;
2.превращение пирувата в ацетил-КоА и его дальнейшего окисления в цикле трикарбоновых кислот (цикл Кребса);
3.цепь переноса электронов на кислород, которая сопряжена с реакциями дегидрирования, происходящими в процессе распада глюкозы.
Первый этап аэробного гликолиза протекает в цитоплазме, второй и третий этап протекает в митохондриях.
Цикл трикарбоновых кислот Кребса, или цикл лимонной кислоты, представляет собой систему, осуществляющую распад продуктов метаболизма и вырабатывающую в ходе этого расщепления основную часть энергии, необходимую для организма. Ферменты цикла трикарбоновых кислот Кребса локализованы так же, как и ферменты клеточного окисления в митохондриях, но в матриксе.
Входе одного цикла Кребса окисляется одна молекула уксусной кислоты до СО2 и Н2О,
иресинтезируется новая молекула щавелевоуксусной кислоты (ЩУК). От окисляемого субстрата 2ē поступают в дыхательную цепь передачи электронов, где акцептором их служит кислород.
Из цикла следует: синтез лимонной кислоты и ее изомеризация в изолимонную кислоту; дегидрирование и декарбоксилирование изолимонной кислоты; окислительное декарбоксилирование α-кетоглутаровой кислоты; деацилирование сукцинил-КоА; дегидрирование яблочной кислоты до щавелевоуксусной кислоты.
Впроцессе аэробного распада глюкозы происходит 6 реакций дегидрирования, одна из них протекает в гликолизе и 5 – в цикле трикарбоновых кислот. Общее количество АТФ при окислении 1 моля глюкозы до СО2 и Н2О составляет 38 молекул АТФ.
Энергия выделяется в виде тепла и 12 молекул АТФ; из них 11 молекул АТФ образуются за счет окислительного фосфорилирования, а 1 – за счет субстратного фосфорилирования.
Регуляция цитратного цикла – аллостерическая регуляция – осуществляется за счет трех регуляторных ферментов: цитратсинтетазы (ингибируется АТФ и НАДН (Н+), активируется инсулином), изоцитратдегидрогеназы (ингибируется АТФ и НАДН (Н+)), сукцинатдегидрогеназы (ингибируется ЩУК, активируется Н3РО4).
Вцикле Кребса идет подготовка субстратов для дыхательной цепи в процессе распада уксусной кислоты. Кроме того, отдельные продукты этого цикла используются для анаболизма, например промежуточный продукт сукцинил-КоА может использоваться для синтеза гема.
Аэробный распад глюкозы происходит во многих тканях и органах и служит основным, но не единственным источником энергии. Некоторые ткани находятся в наибольшей зависимости от катаболизма глюкозы, как источника энергии (например, клетки мозга). Поэтому, недостаточное снабжение мозга глюкозой, или гипоксия, приводят к нарушениям функций мозга (головокружение, судороги, потеря сознания).
Ворганизме постоянный уровень сахара в крови поддерживается благодаря существованию регуляторных нейрогуморальных механизмов. Важнейшая роль в регуляции принадлежит гормонам. Инсулин понижает содержание глюкозы в крови, а глюкогон и адреналин повышают ее.
Концентрация глюкозы в артериальной крови в течение суток поддерживается на постоянном уровне – 3,3-6,2 ммоль/л. После приема углеводной пищи концентрация глюкозы может
22
возрастать в течение 1 часа до 8 ммоль/л (алиментарная гипергликемия), а затем возвращается к нормальному уровню (через 2 часа).
Основным показателем состоянием углеводного обмена служит определение концентрации глюкозы в крови и моче. Гипергликемия (повышение содержания глюкозы в крови) является довольно частым симптомом при различных заболеваниях, прежде всего с поражением эндокринной системы.
Наиболее часто гипергликемия связана с недостаточностью инсулина (сахарный диабет). При сахарном диабете кроме гипергликемии глюкоза появляется и в моче (глюкозурия), уменьшается содержание гликогена в печени, возрастает концентрация кетоновых тел в крови (кетонемия).
Гипергликемия может возникнуть не только при заболевании поджелудочной железы, но и при гипофизарных заболеваниях, опухолях коркового вещества надпочечников, гиперфункции щитовидной железы.
Определение содержания пировиноградной кислоты (ПВК) в сыворотке крови.
ПВК конденсируется с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием гидразона, который в щелочной среде приобретает коричнево-красный цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации ПВК.
Ход определения.
Реактивы, мл |
Опыт |
Стандарт |
Сыворотка крови |
1,0 |
- |
Стандарт ПВК (10мкг/мл) |
-- |
1,0 |
0,1 % 2,4-динитрофенилгидразин |
|
|
(2,4-ДНФГ) |
0,5 |
0,5 |
Перемешивают, помещают в темное место на 20 мин. |
||
2,5 % КОН |
2,5 |
2,5 |
Перемешивают, через 5 минут опытную и стандартную пробы фотометрируют на ФЭКе против воды с синим светофильтром (длина волны 430 нм) в кювете с толщиной оптического слоя 5мм.
Расчет концентрации ПВК в сыворотке крови производят по формуле:
|
Еоп * 10 * 1000 |
|
Еоп |
|
ПВК, мкмоль/л = |
|
= |
|
*113,64, |
|
|
|||
|
Ест * 88 |
|
Ест |
где Еоп и Ест - экстинция опыта и стандарта; 10 - содержание ПВК в стандарте, мкг/мл; 1000 - расчет на 1 л;
88- мкг-молекулярная масса ПВК.
Внорме в сыворотке крови содержится 34,1-102,2 мкмоль/л ПВК. Рост концентрации ПВК в крови наблюдается при авитаминозе и гиповитаминозе В1, при этом значительное повышение ее концентрации наблюдается и в других тканях, особенно в головном мозге. Повышенное содержание ПВК в крови отмечается также при гипоксиях, паренхиматозных заболеваниях печени, сахарном диабете, сердечной недостаточности, токсикозах, гиперфункции ги- пофизарно-адреналовой системы, после введения камфоры, стрихнина, адреналина. При наркозе содержание ПВК в крови снижается.
Обнаружение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в мышцах. Определение активности фермента основано на его способности катализировать реакцию дегидрирования янтарной кислоты с переносом атомов водорода на метиленовый синий, который при этом обесцвечивается.
Ход определения:
Реактивы |
Опыт |
Контроль |
23
Гомогенат |
|
1 мл |
1 мл, кипяченый |
(ткань: 0,9 % NaCl) – 1:20 |
|
|
|
Янтарнокислый Na |
|
10 кап |
10 кап |
(сукцинат Na) |
|
|
|
Метиленовый синий |
|
2 кап |
2 кап |
|
ПЕРЕМЕШАТЬ! |
|
|
Агар-агар |
|
Наслаивать толщиной |
|
(0,5 %, разогретый) |
|
1 см |
1 см |
Пробы поставить в термостат.
Определить время обесцвечивания метиленовой сини.
Активность СДГ в крови, спинномозговой жидкости, околоплодных водах, биопсийном материале определяют при экспериментальных и клинических исследованиях, направленных на изучение биохимических механизмов действия ионизирующего и электромагнитного излучений, вибрации, токсических веществ на организм.
Методы определения концентрации глюкозы в крови
1. Глюкозо-оксидазный метод. β-D-глюкоза под действием фермента глюкозооксидазы окисляется до D-глюконолактона. Образующаяся в данной реакции перекись водорода при участии фермента пероксидазы способствует окислительному азосочетанию 4- аминоантипирина и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель). Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию глюкозы в исследуемом материале и определяется фотометрически.
Схема реакции
глюкозооксидаза
β-D-глюкоза + О2 + Н2О глюконовая кислота + Н2О2
пероксидаза
2 Н2О2 + 4-ААР + фенол хинониминовый краситель + 4 Н2О
Исследуемый материал
Капиллярная или венозная кровь человека.
Для замедления гликолиза и предотвращения свертывания при заборе крови использовать пробирки, содержащие фторид натрия и антикоагулянт. Необходимое количество крови для исследования необходимо сразу после забора внести в пробирку с хлорной кислотой и тщательно перемешать.
Состав набора
Реагент № 1 – буфер. Реагент № 2 – лиофилизат.
Реагент № 3 – депротеинизатор. Калибратор – раствор глюкозы 10 ммоль/л.
Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность
Содержимое одного флакона с реагентом № 2 растворить в содержимом одного флакона с реагентом № 1 при аккуратном перемешивании. Рабочий реагент готов к применению через 2 минуты после растворения.
Рабочий реагент стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С в защищенном от света месте. Необходимо тщательно закрывать флакон с рабочим реагентом после каждого использования.
Калибратор готов к использованию. После вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С
Невскрытые реагенты стабильны в течение года: реагенты № 1 и № 2 в защищенном от света месте; реагент № 2 и калибратор при температуре 2-8 0С, реагенты № 1 и № 3 при комнатной температуре. Срок годности, серия и номер набора по каталогу указаны на упаковке.
Подготовка образцов к анализу
24
Реактивы, мл |
Опытная проба |
Калибровочная |
Контрольная |
|
|
проба |
проба |
Реагент № 3 |
0,50 |
0,50 |
0,50 |
Кровь |
0,05 |
- |
- |
Калибратор |
- |
0,05 |
- |
Вода дистиллированная |
- |
- |
0,05 |
Пробы тщательно перемешать и выдержать в течение 10 минут при комнатной температуре (18-25 0С), после чего опытные пробы центрифугировать с ускорением 900 g в течение 10 минут. Для дальнейшего анализа использовать прозрачную надосадочную жидкость. Надосадочную жидкость опытной пробы можно хранить в герметично закупоренном флаконе при температуре 2-8 0С не более 5 дней.
Процедура анализа
Реактивы, мл |
Опытная про- |
Калибровочная |
Контрольная |
|
ба |
проба |
проба |
Рабочий реагент |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
Надосадочная жидкость опыт- |
0,1 |
- |
- |
ной пробы |
|
|
|
Калибровочная проба |
- |
0,1 |
- |
Контрольная проба |
- |
- |
0,1 |
Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 20 минут при 37 0 С или 30 минут при комнатной температуре. После окончания инкубации измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 500 нм (490-540 нм). Окраска растворов стабильна в течение 1 часа после окончания инкубации при хранении проб в защищенном от света месте при комнатной температуре.
Расчет.
Расчет концентрации глюкозы в крови (С, моль/л) производят по формуле:
Епробы
С = х 10 ммоль/л,
Екалибр
где Епробы – оптическая плотность исследуемой пробы, Екалибр. – оптическая плотность калибровочной пробы, 10 ммоль/л - концентрация глюкозы в калибраторе.
Нормальные показатели
3,50 – 5,70 ммоль/л.
Аналитическая характеристика набора
Линейность – до 30 ммоль/л.
Значение коэффициента вариации - не более 5 %.
Обратите внимание: бледно-розовая окраска рабочего реагента с величиной оптической плотности до 0,250 А, измеренной против дистиллированной воды при длине волны 500 нм, не влияет на правильность определения глюкозы в исследуемом образце.
2. Гексокиназный метод. D-глюкоза под действием фермента гексокиназы при участии АТФ превращается в глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф). Образовавшийся в ходе данной реакции Г-6-Ф под действием фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ) и кофермента НАД превращается в 6-фосфоглюконолактон.
Количество образовавшегося НАДН2 в ходе реакции пропорционально количеству глюкозы в среде инкубации и может быть определено по изменению поглощения при 340 нм.
гексокиназа |
|
D-глюкоза + АТФ |
глюкозо-6-фосфат + АДФ |
Г-6-Ф-ДГ |
|
Глюкозо-6-фосфат + НАД |
6-фосфоглюконолактон + НАДН2 |
Исследуемый материал |
|
25
Свежая сыворотка крови или плазма (гепарин) крови без следов гемолиза, моча, цереброспинальная жидкость. Сыворотку и плазму крови отделить от форменных элементов как можно быстрее. Для замедления гликолиза и предотвращения свертывания при заборе крови использовать пробирки, содержащие фторид натрия и антикоагулянт.
Состав набора
Реагент № 1 – буфер.
Реагент № 2 – стабилизированный раствор ферментов. Калибратор – раствор глюкозы 5,55 ммоль/л.
Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность
Для приготовления рабочего реагента необходимо смешать необходимое количество реагентов № 1 и № 2 в соотношении 100:1. Рабочий реагент стабилен не менее 3 месяцев при температуре 2-8 0С или 2 недели при комнатной температуре. Необходимо тщательно закрывать флаконы сразу после использования.
Калибратор готов к использованию. После вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С
Невскрытые флаконы стабильны в течение года при температуре 2-8 0С. Срок годности, серия и номер набора по каталогу указаны на упаковке.
Процедура анализа
Реактивы, мл |
Опытная про- |
Калибровочная |
Контрольная |
|
ба |
проба |
проба |
Рабочий реагент |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
Исследуемый образец |
0,01 |
- |
- |
Калибратор |
- |
0,01 |
- |
Вода дистиллированная |
- |
- |
0,01 |
Пробы тщательно перемешать и выдержать в течение 5 минут в термостате при температуре 37 0С или 10 минут при комнатной температуре (18-25 0С). После окончания инкубации измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 340 нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см. Величина оптической плотности раствора стабильна не менее 30 минут после окончания инкубации.
Расчет.
Расчет концентрации глюкозы в исследуемом образце (С, моль/л) производят по формуле:
Епробы
С = |
|
х 5,55 ммоль/л, |
|
Екалибр
где Епробы – оптическая плотность исследуемой пробы, Екалибр. – оптическая плотность калибровочной пробы, 5,55 ммоль/л - концентрация глюкозы в калибраторе.
Нормальные показатели
Сыворотка/плазма - 3,9 – 5,8 ммоль/л. Цереброспинальная жидкость – 2,8 – 4,2 ммоль/л.
Аналитическая характеристика набора
Линейность – до 30 ммоль/л.
Значение коэффициента вариации - не более 5 %.
Обмен липидов
Переваривание и окисление липидов
Липиды – гетерогенная группа органических соединений, нерастворимых в воде, но растворимых в органических растворителях. К липидам относятся нейтральные жиры и жироподрбные вещества (липоиды). Липиды содержат в своем составе остатки жирных кислот, которые, взаимодействуя со
26
спиртом, образуют сложные эфиры. В качестве спирта в их состав чаще всего входит глицерин, но может входить и аминоспирт сфингозин. Биологическая роль липидов многообразна, но в основном они выполняют структурную функцию – построение мембран клетки и ее органелл. При окислении липидов высвобождается большое количество энергии (1 г – 38,94·103 Дж).
Нейтральные жиры – сложные эфиры глицерина и высших жирных кислот. Из насыщенных жирных кислот в состав жиров часто входят стеариновая кислота, пальминовая, а из ненасыщенных жирных кислот наиболее важные полинасыщенные: олеиновая, линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты.
Фосфолипиды и фосфатиды содержат, помимо глицерина, жирных кислот, еще фосфорную кислоту и азотистое основание. Фосфатиды можно рассматривать как производные фосфатидной кислоты, соединенной с различным азотистым основанием:
О
||
О СН2―О―С―R1
|||
R2―С―О―СН |
О |
| |
|| |
СН2―О―Р―ОН ← азотистое основание
|
ОН
Фосфатидная кислота
Стерины (холестерин) представляют собой циклический одноатомный ненасыщенный спирт. Стероиды – сложный эфир холестерина с жирной кислотой. Холестерин (80 %) участвует в синтезе желчных кислот, витамина D3, гормонов коры надпочечников и половых, выполняет пластическую функцию.
Полинасыщенные жирные кислоты поддерживают жидкое состояние, присущее липидам клеточных мембран в норме, служат предшественниками тканевых гормоноподобных веществ, простагландинов, предотвращают отложение холестерина и других липидов в стенках кровеносных сосудов, что имеет первостепенное значение в патогенезе атеросклероза.
Жиры являются источником энергии для организма. При нормальном питании жиры дают 40 % энергии. В пищевых продуктах жиры распределены неравномерно: липиды содержатся в мозгах, икре, печени, желтке, нейтральные жиры – в сливочном масле, сале, полинасыщенные жирные кислоты или эссенциальные жирные кислоты (незаменимый фактор питания) – в растительных маслах.
Переваривание липидов происходит в основном в кишечнике под влиянием активной панкреатической липазы, так как в желудочном соке липаза малоактивна и действует только на эмульгированный жир молока. Чтобы подвергнуться действию липаз, липиды должны быть эмульгированы. Основным эмульгатором липидов являются желчные кислоты, вырабатываемые в печени (10-15 г в сутки). В переваривании липидов, помимо липазы, принимают участие фосфолипазы и холестеролэстераза. Эфиры холестерина под действием этого фермента гидролитически распадаются на холестерин и жирную кислоту.
К желчным кислотам относятся холевая, дезоксихолевая, хенодезоксихолевая и литохолевая, которые выделяются в виде парных желчных кислот в связанном виде с гликоколом или с таурином:
О
⁄⁄
NН2―СН2―СН2―S―ОН.
||
О
Эти парные желчные кислоты находятся в виде солей натрия.
Больше всего в организме содержится холевой кислоты в виде гликохолевой кислоты.
27
Желчные кислоты эмульгируют жиры, активируют панкреатическую липазу, активно участвуют во всасывании жирных кислот, образуя мицеллы.
Жирные кислоты всасываются только в комплексе с желчными кислотами. В стенках клетки кишечника этот комплекс распадается, желчные кислоты снова поступают в печень, а в стенке кишечника из глицерина и жирных кислот идет синтез специфического для данного организма нейтрального жира и фосфолипидов. Из клеток кишечника образовавшийся нейтральный жир переходит в лимфатическую систему и частично в кровь, а затем в печень и другие органы, подвергаясь разнообразным превращениям. Этот процесс осуществляется за счет хиломикронов, являющихся транспортной формой липидов. Они синтезируются в желудке, стенке кишечника и состоят из белковой оболочки (2 %) и липидного ядра (98 %). Хиломикроны разрушаются под влияниемфермента липопротеидлипазы, которая активируется гепарином. Липопротеидлипаза находится в крови и во всех тканях.
Жировое депо организма содержит большое количество жиров, которое способно мобилизоваться, т. е. подвергаться липолизу. Мобилизация жира происходит под влиянием клеточной липазы, которая активируется гормонами норадреналином и адреналином (сходство с мобилизацией гликогена). В клетке происходит распад липидов с освобождением энергии и синтез липидов (липогенез), который стимулируется инсулином. Распад глицерина и β-окисление жирных кислот к клетках играют важную роль при освобождении энергии. Проникновение жирных кислот из цитоплазмы внутрь митохондрий, где идет окисление жирных кислот, осуществляется под влиянием переносчика – карнитина.
К кетоновым телам относятся ацетон, β-оксимасляная кислота и ацетоуксусная кислота:
|
|
Н |
|
|
| |
СН3―С―СН3 |
СН3―С―СН2―СООН |
СН3―С―СН2―СООН |
|| |
|| |
| |
О |
О |
ОН |
Ацетон |
Ацетоуксусная кислота |
β-оксимасляная кислота |
Биосинтез кетоновых тел происходит в печени при высокой концентрации в митохондриях ацетилКоА. У здорового человека в печени ацетоацетил-КоА конденсируется с ацетил-КоА с образованием β- окси-β-метилглутарила-КоА. В крови в норме они содержатся в очень небольшом количестве 13,4– 185,2 мкмоль/л (0,14-1,9 мг%). Если биосинтез кетоновых тел превышает потребности организма, они накапливаются в крови (кетонемия) и начинают выводиться с мочой (кетонурия). Это наблюдается при длительном голодании и при заболевании сахарным диабетом. Возрастание концентрации кетоновых тел в крови вызывает кетоацидоз. Кетоацидоз и кетонурия могут быстро привести к нарушению ионного гомеостаза и кетоацидозной коме. У здоровых людей после 1-2 недель голодания кетоновые тела начинают использоваться в качестве источника энергии некоторыми тканями (нервная ткань).
Полиненасыщенные жирные кислоты вступают при определенных условиях в реакции свободного радикального окисления, промежуточным продуктом таких реакций явдяется перекиси липидов. Поэтому такой процесс называется перекисным окислением липидов (ПОЛ). Реакции перекисного окисления липидов инициируются в живом организме активными формами кислорода, которые образуются в живых клетках в результате последовательного присоединения электронов к молекуле кислорода (до 4 электронов). К активной форме кислорода относят гидроксильный радикал (ОН*), супероксидный анион радикал (О2*-), пероксид водорода (Н2О2).
Активные формы кислорода легко окисляют, кроме полиненасыщенных жирных кислот, белки, азотистые основания, входящие в структуру ДНК, различные мембранные структуры клеток. В результате появления в гидрофобном слое мембран гидрофильных зон за счет перекисей жирных кислот в клетки могут проникать вода, ионы натрия, кальция, что приводит к набуханию клеток, органелл и их разрушению.
Активация ПОЛ характерна для многих заболеваний: дистрофии мышщ, болезни Паркинсона, при атеросклерозе, развитии опухолей. ПУЛ резко активируется при реоксигенации тканей, например, при спазме коронарных артерий и их последующем расширении.
Выделяют систему защиты клеток от активных форм кислорода, которая называется антиаксидантной системой. К ней относятся ферменты антиоксидазного действия – супероксид дисмутаза (СОД),
28
которая переводит супероксидные радикалы в перекись водорода, каталаза (разрушает перекись водородв до воды и молекулярного кислорода), система глутатиона. Система глутатиона включает фермент глутатионпероксидазу, которая разрушает перекиси органического происхождения с участием восстановленного глутатиона и глутатионредуктазу, которая в последующем восстанавливает глутатион.
Кроме того, существуют жирорастворимые антиоксиданты (витамин Е, β-каротин и др.) и водорастворимые антиоксиданты, такие как витамин С, мочевая кислота и др. соединения.
Антиоксиданые системы наряду с прооксидантными поддерживают низкий уровень перекисного окисления липидов в клетках, как нормально существующий процесс.
Как физиологическое явление увеличение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наступает через 1-4 ч после принятия пищи. Концентрация липидов крови увеличивается (гиперлипемия) при диабете (до 10-20 г/л), липоидном нефрозе, циррозе печени, ожирении, атеросклерозе, ишемической болезни сердца, гипотиреозе, панкреотите.
Концентрация свободных неэстерифицированных жирных кислот в сыворотке крови увеличивается при сахарном диабете, после введения адреналина, при голодании, поскольку идет мобилизация жира из жирового депо, и свободные жирные кислоты транспортивуются в комплексе с альбуминами. Уменьшается содержание свободных жирных кислот в сыворотке крови после введения инсулина и глюкозы.
Качественная реакция (Петтенкофера) на желчные кислоты. При взаимодействии желч-
ных кислот с оксиметилфурфуролом, образующимся из сахарозы под действием концентрированной серной кислоты, появляется красно фиолетовое окрашивание.
Ход определения. В сухую чашку Петри, под которую подложен лист белой бумаги, наносят 2 капли желчи, 2 капли 20 % раствора сахарозы и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем приливают 7 капель концентрированной серной кислоты и снова перемешивают. Окрашивание пробы в красно фиолетовый цвет, определяемый на белом фоне, свидетельствует о наличии желчных кислот в данном биологическом материале.
Диагностическое значение имеет определение желчных кислот в моче, кале и дуоденальном содержимом. В норме моча человека содержит минимальное количество желчных кислот, не выявляемое данным методом. Их количество увеличивается при механической и паренхиматозной желтухах, но не изменяется при гемолитической. Выделение желчных кислот с калом наблюдается при усиленной перистальтике кишечника.
Определение концентрации триглицеридов в сыворотке и плазме крови энзиматическим методом. Липаза катализирует гидролиз липидов до глицерина и жирных кислот. Глицерин запускает ряд сопряженных ферментативных реакций с участием ферментов глицерокиназы в присутствии АТФ и глицеролфосфатоксидазы. Образующаяся в ходе данных реакций перекись водорода при участии фермента пероксидазы способствует окислительному азосочетанию 4-аминоантипирина и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель). Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию триглицеридов в исследуемом материале и определяется фотометрически.
липаза
триглицериды глицерин + жирные кислоты,
глицерокиназа
глицерин + АТФ |
глицерол-3-фосфат + АДФ, |
глицеролфосфатоксидаза
глицерол-3-фосфат + О2 диоксиацетонфосфат + Н2О2
пероксидаза
2 Н2О + 4-ААР + фенол хинониминовый краситель + 4 Н2О
Исследуемый материал
Свежая сыворотка крови, гепаринизированная или ЭДТА-плазма крови без следов гемолиза. Забор крови желательно производить после 12-ти часового голодания. Исследуемый материал может храниться 3 дня при температуре 2 – 8 °С.
Состав набора
Монореагент.
29
Калибратор - 2,29 ммоль/л.
Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность
Монореагент готов к применению. После вскрытия флакона монореагент стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 °С в защищенном от света месте. Необходимо тщательно закрывать флакон с монореагентом после каждого использования.
Бледно-розовая окраска монореагента с величиной оптической плотности до 0,250 А, измеренной против дистиллированной воды при длине волны 500 нм, не влияет на правильность определения триглицеридов в исследуемом образце. Необходимо избегайть контакта монореагента с источниками глицерина извне (мыла, крема и др.). Калибратор готов к применению. После вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 °С.
Невскрытые реагенты стабильны в течение года при температуре 2-8 °С, монореагент в защищенном от света месте. Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.
Реактивы, мл |
Опытная проба |
Калибровочная про |
Контрольная проб |
Монореагент |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
Сыворотка, плазма |
0,02 |
- |
- |
Калибратор |
|
0,02 |
- |
Вода бидистиллированная |
|
- |
0,02 |
Процедура анализа
Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 15 минут при комнатной температуре (18-25 °С) или 10 минут при температуре 37 °С. После окончания инкубации измеряю оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы при длине волны 500 нм (490-540 нм).
Окраска растворов стабильна втечение 1 часа после окончания инкубации при хранении проб в защищенном от света месте при комнатной температуре. Объемы исследуемого образца и монореагента можно изменить, соблюдая соотношение 1:100.
Расчет
Расчет концентрации триглицеридов (С, ммоль/л) проведите по формуле:
Епробы
С = |
|
х 2,29 ммоль/л |
|
Е калибр.
где Епробы – единица оптической плотности исследуемой пробы, Екалибр. - единица оптической плотности калибровочной пробы, 2,29 ммоль/л -концентрация триглицеридов в калибраторе.
Нормальные показатели
0,15 - 1,71 ммоль/л или 13 - 160 мг/100 мл.
Группа риска: 1,71 - 2,29 ммоль/л или 160 - 200 мг/100 мл. Патологические показатели: >2,29 ммоль/л или 200 мг/100 мл.
Аналитические характеристики набора
Линейность - 0,1-11,4 ммоль/л. Коэффициент вариации - не более 5%.
Наибольшее клиническое значение имеет определение концентрации общих липидов при фенотипировании гиперлипидемий. Кроме того, повышение данного показателя наблюдается при нефротическом синдроме, массивных переломах трубчатых костей, гипотиреозе, хроническом алкоголизме, возможно и алиментарное происхождение.
Влияние активации перекисного окисления липидов на устойчивость эритроцитарной мембраны. Избыточная генерация свободных радикалов (O2-, OH-, HO2-, H2O2 и др.) играет ведущую роль в патогенезе повреждения клеток при целом ряде патологических состояний. Окислительный стресс нарушает структуру всех макромолекул и надмолекулярных комплексов: повреждаются белки,
30