САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЯСА НА НАЛИЧИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Выявление бактерий туберкулеза

Бактериологическое исследование мяса с целью выделения и идентификации микобактерий проводят при обнаружении в лимфатических узлах, внутренних органах или других тканях патологии, характерной для туберкулеза (творожистые узелки, склонные к распаду). Для анализа отбирают участки пораженных органов и тканей, лимфатические узлы (бронхиальные, заглоточные, средостенные, предлопаточные, надвымянные), обработанные 3-10%-ным раствором серной кислоты. Материал в лабораторию лучше доставлять свежим. При отсутствии такой возможности лимфоузлы, кусочки органов и мышц консервируют 30-40% водным раствором глицерина.

Бактериологический диагноз основан на микроскопии препаратов из патологического материала, окрашенных по Цилю— Нильсену, выделении чистой культуры возбудителя на специальных средах (яичные, картофельные с глицерином) и заражении лабораторных животных (морских свинок, кроликов). Для повышения концентрации возбудителя туберкулеза в пробах применяют специальные методы обработки патологического материала (например, флотацию).

Пораженные органы и ткани нарезают кусочками и растирают в стерильной ступке или измельчают в гомогенизаторе с 6%-ной серной кислотой (1:4). Затем фильтруют через марлевый фильтр, центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, а из осадка готовят мазки. Проводят первичный посев на питательные среды и заражение лабораторных животных.

Морфологические и культуральные свойства. Туберкулезные микобактерии при окрашивании по Цилю—Нильсену приобретают розово-красный цвет на фоне посторонней микрофлоры и тканевых элементов мазка синего цвета; при окрашивании по Граму — фиолетовый (грамположительные). Это тонкие прямые, слегка изогнутые палочки длиной 1,5-4мкм, шириной 0,3-0,6 мкм, располагающиеся одиночно или небольшими скоплениями. Иногда обнаруживается зернистость, которая обусловлена наличием в цитоплазме грамположительных некислотоустойчивых так называемых «зерен Муха». Возбудитель туберкулеза относится к группе кислото-спирто-щелочеустойчивых микроорганизмов, так как в его оболочке содержится 10-40% стеариновых кислот и других воскоподобных веществ. Неподвижен, спор и капсул не образует.

Экспресс-идентификацию микобактерий в мясе проводят люминесцентным методом в соответствии с инструкцией по его применению. Для первичного посева используют специальные питательные среды с pH 6,4-7,2; МПА и МПБ с глицерином, яичные среды Петраньяни, Петрова, Левенштейна—Йенсена, синтетическую среду Сотона, в состав которой входят аспарагин, глицерин и соли (железа цитрат, калия фосфат и др.).

Возбудитель туберкулеза относится к строгим аэробам, оптимальная температура роста 37-38°С (может расти в диапазоне 30-42°С), развивается медленно - от 2 нед до 2 мес. Наличие роста учитывают каждые 5-7 сут.

На МПА с 2-3% глицерина образуются сухие бородавчатые колонии (нередко сморщенные или в виде узелков); на картофеле, пропитанном 3-4%-ным глицерином, — сероватые колонии, имеющие вид бородавчатых образований. На среде Петраньяни микобактерии дают серовато-зеленоватые колонии, на бульоне с 4-5 % глицерина образуют нежную пленку, иногда сетчатую, которая постепенно утолщается, становится ломкой и с бугристо-морщинистой поверхностью, бульон при этом остается прозрачным.

После выделения чистой культуры микобактерий определяют ее видовую принадлежность. Одним из распространенных методов дифференциации является культивирование в глицериновом бульоне с добавлением 5% желчи. Каждый вид микобактерий лучше растет в присутствии желчи соответствующего вида животного: Mycobacterium avium - в присутствии только птичьей желчи, М. bovis - с добавлением желчи КРС.

Биологическая проба. Для установления патогенности и определения вида возбудителей туберкулеза заражают морских свинок, кроликов и при необходимости кур, предварительно проверенных аллергическим методом для исключения спонтанного туберкулеза. Для инфицирования применяют выделенную культуру или нативный материал. Последний предварительно обрабатывают серной кислотой, растирая в стерильной ступке. К осадку после центрифугирования добавляют 15%-ный раствор натрия бикарбоната, оставляют на 10—15 мин и вновь центрифугируют в течение 5 мин. Образовавшийся осадок дважды промывают стерильным физиологическим раствором натрия хлорида с последующим центрифугированием, а затем вновь эмульгируют в физиологическом растворе и отстаивают 10 мин. Надосадочную жидкость вводят по 1—2 мл морским свинкам в паховую область и кроликам внутривенно.

У морских свинок в положительных случаях через 2 нед на месте инъекции образуется уплотнение, а затем язва с одновременным увеличением региональных лимфоузлов. Этим свинкам через 2-3 нед подкожно вводят туберкулин, что приводит к бурной генерализации процесса и гибели животных. При вскрытии из типичных туберкулов делают мазки и высев на питательные среды. М. bovis вызывает генерализованный процесс туберкулеза у кроликов и морских свинок. М. avium обусловливает у кроликов септический процесс без образования специфических бугорков и приводит к быстрой гибели животных, особенно при внутривенном заражении.

Выявление бактерий туляремии

Для бактериологического исследования с целью выделения культуры возбудителя кроме общепринятых проб отбирают увеличенные лимфатические узлы с казеозным перерождением.

Исследование включает три этапа:

-микроскопию мазков-отпечатков, приготовленных из нативного материала, окрашенных по Граму или по методу Романовского-Гимзы либо разведенным фуксином;

-посев на питательные среды для получения чистой культуры возбудителя, его идентификация;

-заражение лабораторных животных в необходимых случаях.

При микроскопии препаратов-отпечатков обнаружение возбудителя туляремии удается лишь при обильном обсеменении исследуемого материала. Это тонкая мелкая палочка размером 0,3 - 0,7 мкм, спор не дает, в организме больных иногда образует нежную капсулу; по Романовскому-Гимзе окрашивается в розово-голубой цвет, грамотрицательна, нередко биполярна.

Первичный посев проводят на специальные питательные среды с добавлением ростовых факторов и глюкозы, так как возбудитель туляремии на простых питательных средах не растет; pH сред 7-7,3. Наиболее часто используют желточную среду Мак-Коя, на которой

вырастают мелкие прозрачные или молочного цвета слизистые колонии; в цистеиноглюкозном бульоне на поверхности образуют нежную пленку. Микроорганизм обладает слабой ферментативной активностью в отношении глюкозы, мальтозы, маннозы, декстрина, глицерина, которые расщепляет только до кислоты (без газа). Протеолитическими свойствами практически не обладает. Некоторые культуры при росте

на кровяных средах дают α-гемолиз. При культивировании следует учитывать, что

типичной формой колонии является гладкая (S-форма), обладающая Vi- и О-антигенами, вирулентная и иммуногенная. R-форма Fr. tularensis содержит лишь О-антиген. Авирулентна. При серологической диагностике учитывают наличие в бактериальной клетке антигенов, общих с бруцеллами.

Выделенную культуру идентифицируют пробирочным методом в реакции агглютинации. В качестве антигена используют 2-суточную культуру, выращенную на среде Мак-Коя. Микробную массу снимают петлей (смывать нельзя), суспендируют в физиологическом растворе, доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 5 млрд по стандарту для туляремийного возбудителя. Микробную взвесь добавляют в пробирки со специфической сывороткой в разных разведениях не менее чем до 1: 2000, встряхивают и помещают на 2 ч в термостат. Затем оставляют при комнатной температуре на 20-22 ч. Положительным результатом считают четко выраженную агглютинацию при полной прозрачности жидкости.

Биологическая проба. Определение патогенности возбудителя туляремии основано на заражении морских свинок, белых мышей или кроликов, которым подкожно или внутрибрюшинно вводят суспензию растертых тканей патологического материала в дозе 0,5 мл свинкам и мышам и 1,5 мл кроликам. Белые мыши погибают на 3 сутки, морские свинки, кролики — через 4-5 сут. При вскрытии павших лабораторных животных отмечают некротические очаги в легких, селезенке, печени, лимфатических узлах; наличие возбудителя заболевания подтверждают посевом на специальные питательные среды и выделением чистой культуры.

Выявление бактерий лептоспироза

Лабораторное исследование мяса при подозрении на происхождение его от больных лептоспирозом животных предусматривает: микроскопию мазков-отпечатков из паренхиматозных органов в темном поле; посев в специальные питательные среды с последующей идентификацией выделенных культур; биологическую пробу на лабораторных животных. Необходимо учитывать, что материал должен быть взят и исследован в течение 6 ч в летнее время и 10-12 ч при хранении в охлажденном состоянии.

Препарат для микроскопии готовят в виде раздавленной капли, не допуская образования пузырьков воздуха. С этой целью кусочки исследуемого органа массой 3 г растирают в ступке с 5 мл питательной среды (физиологический раствор) до получения гомогенной взвеси. Суспензию отстаивают в холодильнике 2 ч или центрифугируют при частоте вращения 3000 об/мин в течение 10 мин и микроскопируют надосадочную жидкость в темном поле.

Лептоспиры представляют собой спиральные тонкие серебристые нити, концы которых (оба или один) загнуты и булавовидно утолщены. Микроорганизмы подвижны. Возможность безошибочной дифференциации лептоспир от других видов по морфологическим признакам служит основанием для установления диагноза на

лептоспироз только по данным бактериоскопии без выделения чистых культур и их идентификации.

При убое клинически здоровых животных и возникшем подозрении на лептоспироз обязательно делают посевы из почки и мочевого пузыря в пробирки с питательной средой (мочу засевают по 1—3 капли в пробирку). Для выделения культур из почки ее освобождают от капсулы, поверхность прижигают и набирают материал пипеткой, введенной параллельно поверхности в корковый слой. Высев делают у КРС из двух-трех долей почки, у свиней — из нескольких участков органа.

На простых питательных средах лептоспиры не растут, для их культивирования используют специальные жидкие среды: водно-сывороточную, а также полужидкую среду Флетчера. Посевы выдерживают при 28-30 °С 20 сут. Внешний вид питательной среды не изменяется, при просмотре в проходящем свете она опалесцирует, при встряхивании образует нежные муаровые волны. Наличие роста подтверждают бактериоскопией капли среды.

Биологическая проба. Восприимчивы к лептоспирозу при экспериментальном заражении золотистые хомяки, крольчата, морские свинки, щенки собак, котята, белые и серые мыши. Лабораторных животных заражают кровью, мочой, суспензией из паренхиматозных органов для выделения чистых культур лептоспир из нативного материала, определения вирулентности и дифференциации от сапрофитов. Исследуемый материал вводят подкожно или внутрибрюшинно золотистым хомякам в дозе от 0,5 мл, крольчатам — по 2 мл. На каждую пробу исследуемого материала необходимо брать по два животных: одно из них убивают на 4 сутки, другое — на 14 после заражения, их кровь исследуют в реакции микроагглютинации (РМА), начиная с разведения 1:10 с лептоспирами 13 серологических групп. Положительная РМА свидетельствует о наличии лептоспир в материале.

Высевы от убитых и павших животных делают из сердца, печени и почки пробирки из каждого органа, одновременно проводят микроскопию. Культуры лептоспир чаще удается выделить из органов при проявлении клинических признаков болезни, поэтому в период лихорадки берут кровь шприцем из уха и сердца и проводят посев на питательные среды.

Патогенность и вирулентность выделенных культур лептоспир проверяют на золотистых хомяках или крольчатах. Патогенные лептоспиры способны размножаться в организме животного, вызывать клинические проявления болезни, характерные патологоанатомические изменения и гибель животного. Сапрофитные лептоспиры такими свойствами не обладают. Заражение животных проводят внутрибрюшинно 5 суточной культурой, содержащей 70-100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Если золотистые хомяки погибают на 5—12-е сутки от дозы менее 0,1 мл, то культуры считаются высоковирулентными, от дозы 0,2-0,4 мл — средней вирулентности и от 0,5 до 1 мл — слабовирулентными.

Выявление бактерий синегнойной палочки

Морфологические и культурально-биохимические свойства. Наличие на МПА сероватозеленых блестящих маслянистых колоний с валиком по периферии и специфическим запахом земляничного мыла, а на селективно-дифференциальных средах (Эндо, Смирнова и др.) обильного роста розоватых с белым валиком, сиреневатых и другого оттенка колоний в тон среды с ровными или изрезанными краями, при микроскопии мазков, из которых обнаруживаются полиморфные подвижные грамотрицательные палочки,

Наличие роста на чашках с элективными средами (Эндо, Левина, Плоскирева) окрашенных колоний, вследствие ферментации ими лактозы и изменения цвета индикатора - лактозоположительных вариантов кишечной палочки (или не изменяющих цвета среды колоний лактозоотрицательных) требует их определения для установления присутствия их в мясе или паренхиматозных органах и дифференциации по биохимическим свойствам от других сходных бактерий из семейства кишечных.

На агаре Эндо бактерии E.coli растут в виде красных с металлическим блеском колоний; на эозин-метиленовом синем агаре (агаре Левина) - в виде темно-фиолетовых блестящих колоний; на бактоагаре Плоскирева - в виде кирпично-красных с глянцевой поверхностью колоний.

Из колоний, характерных для бактерий кишечной палочки, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Эшерихии – это мелкие палочки с закругленными концами по Граму окрашиваются отрицательно. Для определения подвижности культуры готовят препарат "раздавленная капля" и микроскопируют. Эшерихии чаще подвижны.

При наличии колоний, характерных для бактерий кишечной палочки-Эшерихии, их дифференцируют от других сходных микроорганизмов по биохимическим свойствам. E.coli чаще образуют индол и окрашивают индикаторную бумажку в красный цвет, но не образуют аммиак и сероводород.

Для установления способности E.coli расщеплять мочевину, испытуемую культуру засевают на трехсахарный агар с мочевиной и выдерживают 24 ч в термостате при температуре 37°С. E.coli не расщепляют мочевину и не изменяют цвет среды. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, реакция среды становится резко щелочной, и среда окрашивается в ярко-красный цвет.

Ферментацию лактозы устанавливают посевом испытуемой культуры в среду Гисса, содержащую 10% лактозы, большинство бактерий E.coli ферментируют 10%-ную лактозу.

Выявление бактерий из рода протея

Сущность метода выявления бактерий из рода протея заключается в определении морфологии, определении роста на питательных средах и способности гидролизовать мочевину, образовании сероводорода и отсутствии ферментации маннита.

Наличие на средах в чашках вуалеобразного налета (Н-форма), при микроскопии которого обнаруживают полиморфные подвижные палочки, окрашивающиеся по Граму отрицательно, указывает на присутствие вульгарного протея; наряду с колониями, которые дают расплывающийся по поверхности рост, могут встречаться изолированные колонии средней величины, нежные полупрозрачные с розоватым центром, палочки из этих колоний лишены жгутиков и неподвижны (О-форма).

Для подтверждения наличия протея (Н-форма) производят посев в конденсационную воду скошенного агара (способ Шукевича).

Для обнаружения "нероящихся" О-форм производят посев на агар Плоскирева. О-форма протея растет на этой среде в виде прозрачных колоний, обладающих характерным запахом и слегка подщелачивающих среду, которая окрашивается около них в желтый цвет. Более старые колонии нередко мутнеют, а их центр принимает бурую окраску.

Метод ускоренного выявления возбудителей рожи свиней, листериоза, сальмонеллеза при помощи флуоресцирующих антител

Сущность метода заключается в определении способности антител иммунных сывороток при соединении через карбамидные группы со специальными красителями (флуорохромами) вступать в специфическую связь с соответствующими антигенами. Образующийся при этом комплекс "антиген-антитело" флуоресцирует и легко обнаруживается при люминесцентной микроскопии.

Этот метод проводится в начале исследования наряду с бактериоскопией и не требует выделения чистой культуры микробов из исследуемого материала. Полученный в течение 2-6 ч ответ является предварительным, сигнальным, требующим подтверждения бактериологическим методом.

Для люминесцентной микроскопии мяса или паренхиматозных органов готовят взвесь с физиологическим раствором и растирают стерильным битым стеклом в ступке. После осаждения крупных частиц взвеси готовят по два-три мазка на каждый вид сыворотки.

Перед применением флуоресцирующую сыворотку разводят физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7,4) до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Сыворотки в рабочем разведении могут храниться при температуре 2-4 °С в течение 2 суток. Мазки готовят средней густоты (несколько десятков микробов в поле зрения микроскопа) размером не более 1см. Место нанесения культуры очерчивают карандашом по стеклу с обратной стороны, подсушивают мазки на воздухе, маркируют и фиксируют этиловым спиртом в течение 15 мин. После фиксации и испарения спирта мазки ополаскивают физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7,4). На слегка подсушенный мазок наносят одну-две капли соответствующей люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. Мазки с сывороткой помещают во влажную камеру (в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне) и выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин. Затем сыворотку отмывают, погружая мазки в кювету, содержащую физиологический раствор с фосфатным буфером рН 7,4 на 20 мин. Раствор в кювете периодически помешивают и меняют через 10 мин. На поверхность мазка наносят небольшую каплю глицерина с буфером рН 8,0, накрывают покровным стеклом, излишек глицерина удаляют. На покровное стекло наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло или его заменитель и производят люминесцентную микроскопию.

Если реакция положительна, наблюдается яркая, сверкающая зеленая люминесценция морфологически типичных бактерий.

Методы выявления анаэробных бактерий

Сущность метода выявления анаэробных бактерий заключается в определении их способности расти в отсутствии кислорода воздуха, морфологии возбудителей, роста на питательных средах и на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.

Удовлетворительные анаэробные условия создаются в жидкой питательной среде, где в качестве восстановителя применяют мясо, печень, которые одновременно служат и источником питания.

Среда должна быть фасована во флаконы или пробирки таким образом, чтобы площадь поверхности среды по абсолютной величине не превышала ее объема, и поверхность ее была изолирована от кислорода воздуха.

Исследование на анаэробные бактерии проводят при подозрении на следующие заболевания: эмфизематозный карбункул (эмкар), злокачественный раневой газовый отек, брадзот овец, дизентерию ягнят, энтеротоксемию овец, столбняк, некробактериоз, ботулизм.

Материалом для исследования при эмкаре и злокачественном раневом газовом отеке являются кусочки пораженных мышц, отечные ткани, лимфатические узлы, печень и селезенка; при брадзоте овец - кровь из сердца, слизистая оболочка сычуга и тонкого отдела кишечника, инфильтрат подкожной клетчатки; при дизентерии ягнят и энтеротоксемии овец - содержимое кишечника, пораженная почка; при столбняке - раневой секрет, гной, кусочки тканей, которые берут из глубоких слоев пораженных участков; при некробактериозе - некротические фокусы паренхиматозных органов; при ботулизме - содержимое желудка, толстых кишок, селезенка, кусок печени и головной мозг.

Диагноз на анаэробные инфекции ставят на основании бактериоскопии, посева материала и биопробы на животных.

Для бактериоскопии из материала готовят несколько мазков или мазков-отпечатков, которые окрашивают метиленовой синью или по Граму. При просмотре мазков обращают внимание на форму, расположение отдельных микробов, наличие и расположение спор, наличие капсул и отношение к окраске по Граму.

Для посева материал обжигают и навеску массой 10 г растирают в стерильной ступке с добавлением двойного количества физиологического раствора. По 3-5 приготовленной взвеси засевают в четыре большие пробирки с мясной средой Китт-Тароцци, залитой слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см, предварительно прогретой в кипящей водяной бане в течение 20-30 мин, а затем быстро охлажденной до температуры не ниже 50 °С. Посевы перед термостатированием прогревают для всех указанных анаэробов две пробирки при температуре 80°С в течение 20 мин; при исследовании на Cl. botulinum одну пробирку при температуре 60°С в течение 15 мин (при этом сохраняются споры Cl. Botulinum), а другую при 80 °С в течение 20 мин. Остальные пробирки оставляют непрогретыми.

При подозрении на Cl. botulinum две пробирки - одну непрогретую и одну прогретую при 60°С выдерживают при температуре 28°С. Другие две пробирки (непрогретую и прогретую при 80°С) инкубируют при температуре 37°С на другие анаэробные бактерии.

Термостатирование проводят в течение 5-10 суток; наблюдение за ростом производят ежедневно. При обнаружении роста производят микроскопическое исследование.

Выделение чистой культуры производится по следующей методике (метод рассева по Вейону-Виньялю).

Готовят полужидкий агар (0,5%) с 0,5% глюкозы и разливают в пробирки по 9 мл; агар подогревают до температуры 55 °С и производят посев в убывающем порядке: в первую пробирку засевают 1 см культуры из бульона Китт-Тароцци, во вторую - 1 мл из первой пробирки, в третью - 1 мл из второй и так до пятой пробирки.

После тщательного перемешивания полученных разведений культуры из каждой пробирки среду переливают в стеклянные трубки (длиной 20 см и диаметром 0,75 см),

один конец которых закрыт ватой, а другой – оттянут для последующей запайки. Трубки со средой быстро остужают и помещают в термостат с температурой 37 °С. На 2-5 сутки посевы в трубках просматривают и отмечают рост отдельных колоний. При наличии газа столбик агара разрывается. В местах нахождения отдельной колонии трубку надпиливают, фламбируют над пламенем и разламывают. Колонию снимают петлей вместе с агаром и переносят в пробирку со средой Китт-Тароцци.

В случае необходимости изучают культуральные и биохимические свойства выделенной чистой культуры.

Для биологической пробы используют исходный материал, а также культуру.

При подозрении на эмфизаматозный карбункул или злокачественный отек заражают внутримышечно морскую свинку взвесью в дозе 0,5 мл, которая погибает через 16-36 ч; при подозрении на брадзот овец заражают подкожно или внутримышечно морскую свинку, которая погибает через 1-2 суток; при подозрении на дизентерию ягнят и энтеротоксемию овец для внутримышечного заражения используют кроликов или морских свинок, которые погибают в течение первых суток; при подозрении на столбняк заражают фильтратом из культуры в дозе 0,5 мл подкожно белых мышей в области корня хвоста, животные погибают на 3-4 сутки; при подозрении на некробактериоз заражение в дозе 0,5-1 мл кроликов и белых мышей производят под кожу в области уха (кролик) или живота (мышь). На месте инъекции, особенно на ухе, появляются некрозы. Животные погибают через 5-10 суток.

Исследование на определение ботулизма (токсинообразование) проводят на белых мышах.

Нейтрализация токсина противоботулинической сывороткой.

Используемый материал предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:2, выдерживают при комнатной температуре 1-1,5 ч для экстрагирования токсина, затем настой фильтруют через ватномарлевый фильтр или центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15-20 мин.

Нейтрализация токсина: к 0,5-0,8 мл фильтрата добавляют 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.

Двум мышам вводят по 0,5-0,8 мл исследуемого фильтрата внутрибрюшинно или внутривенно. Другим двум мышам вводят смесь фильтрата и сыворотки.

Если мыши, получившие фильтрат, не обработанный противоботулинической сывороткой, погибают, результат биопробы положительный (в мясе имеется токсин). Мыши, которым вводилась смесь фильтрата с сывороткой (контрольные), выживают.

В случае гибели всех четырех мышей следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз.

При обнаружении в испытуемом материале ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками.