2 курс / Микробиология 1 кафедра / 7

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1.Неклостридиальные анаэробы в патологии человека, микробиологическая диагностика.

Неклостридиальные (неспорообразующие) анаэробы являются предста-

вителями симбионтной микробиоты ротовой полости, верхних дыхательных путей, кишечника, влагалища и др. биотопов макроорганизма. По таксономической характеристике они относятся к различным родам (табл. 2).

Чистые культуры неклостридиальных анаэробов. Окраска по Граму.

13

Неклостридиальные анаэробы (НА): условно-патогенные микроорга-

низмы, которые могут вызывать различные эндогенные инфекции при снижении иммунного статуса организма.

Факторы патогенности для большинства НА:

1.Факторы адгезии.

2.Капсула.

3.Ферменты патогенности (гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин).

4.Эндотоксин, цитотоксин.

НА чаще вызывают заболевания в ассоциациях, что приводит к более быстрому и тяжелому течению заболевания.

Все НА, за исключением бифидо- и лактобактерий, могут вызывать следующие гнойно-септические заболевания:

послеоперационные абдоминальные инфекции: перитонит, аппендицит, абсцесс печени;

гинекологические инфекции: септический аборт, эндометрит;

аспирационную пневмонию, абсцесс легкого;

сепсис, эндокардит;

флегмоны, абсцессы кожи и мягких тканей, остеомиелит (при ушибах и травмах);

одонтогенные инфекции после удаления или пломбирования зубов.

Лактобактерии значительно реже, чем другие НА, вызывают заболевания и могут быть причастны к формированию кариеса, острого язвенного стоматита, язвенного вульвита.

Бифидобактерии чрезвычайно редко, на фоне глубокого иммунодефицита, могут вызывать септицемию.

Микробиологическая диагностика.

Микробиологическая диагностика необходима для этиологической расшифровки заболеваний и определения чувствительности возбудителей к антибиотикам.

Материал на исследование (в зависимости от клинической формы): кровь, гной, пунктаты абсцессов и полостей, отделяемое из глубоких отделов ран, язв, свищей и др.

1.Экспресс-методы:

микроскопия нативных мазков в окраске по Граму;

газовая хроматография, основанная на обнаружении продуктов метаболизма анаэробов (летучие жирные кислоты – муравьиная, уксусная, пропионовая).

2.Бактериологический метод (основной). Материал доставляют в одноразовых шприцах или в стерильных пробирках с транспортной средой для анаэ-

14

робных микроорганизмов. Необходимое условие: быстрая (не позднее 2-х часов) доставка исследуемого материала в лабораторию. Производят посев на специальные для анаэробов питательные среды. Посевы инкубируют в анаэростатах, заполненных газовой смесью (80% N2, 10% H2 и 10% CO2), или с помощью AnaeroHiGas Pak, с дальнейшей идентификацией выделенных возбудителей и определением чувствительности к антибиотикам.

Специфическая профилактика и специфическая терапия не разработаны.

2.Характеристика возбудителей газовой гангрены, микробиологическая диагностика, специфическая профилактика и лечение.

Основной возбудитель газовой гангрены Clostridium perfringens (7080%). Реже заболевания вызывают: Clostridium novyi (20-40%), Clostridium septicum (до 20%), Clostridium histolyticum (4-6%) и др.

Морфо-тинкториальные свойства: C.perfringens крупные, неподвижные грамположительные палочки, имеют капсулу, образуют спору, расположенную центрально или субтерминально. Диаметр споры превышает диаметр клетки.

Чистая культура C.perfringens. Окраска по Граму.

Культуральные свойства: факультативный анаэроб. На среде КиттаТароцци – помутнение, на среде Вильсона-Блера – рост в виде черных колоний. Характерной особенностью роста возбудителя на этих средах является интенсивное газообразование с разрывами агара. На кровяном агаре Цейсслера растут в виде гладких сероватых колоний с зонами гемолиза.

Рост C.perfringens на специальной среде Вильсона-Блера.

15

Антигенная структура: выделяют 6 сероваров (A-F). Заболевания человека чаще связаны с сероваром А.

Факторы патогенности: характерной особенностью возбудителей газовой гангрены является многообразие продуцируемых токсинов, обозначаемых буквами греческого алфавита. Причем, у каждого вида и серовара свой набор ток-

сических факторов, которые представляют собой не только экзотоксины, но

и различные ферменты патогенности:

α-токсин (лецитиназа С) обладает дермонекротическим действием, что приводит к некрозу мышечной ткани. Лецитиназа также вызывает лизис эритроцитов и повреждает липидные мембраны нервных клеток;

коллагеназа, гиалуронидаза, ДНК-аза, гемолизин – усиливают действие α-

токсина;

энтеротоксин (экзотоксин) – вызывает пищевые отравления при массивном обсеменении пищевых продуктов (см. учебно-методическое пособие «Основная бактериальная патология желудочно-кишечного тракта»).

Газовая гангрена чаще возникает при различных травмах вследствие инфицирования ран почвой, содержащей споры возбудителя.

Признаки газовой гангрены.

1.Некроз мышечной ткани.

2.Интенсивное накопление газов (H2, CO2, H2S, аммиак и др.) в пораженных тканях, что определяется при пальпации кожных покровов (симптом крепитации).

3.Обширный отек тканей. Из раны выделяется серозно-геморрагический экссудат с гнилостным запахом.

4.Сепсис и синдром токсического шока, что обычно приводит к летальному исходу.

Микробиологическая диагностика.

Материал на исследование: мазки-отпечатки из раны, кусочки некротизированных тканей, отечная жидкость, перевязочный материал, кровь (при подозрении на сепсис).

1.Бактериоскопический метод: микроскопия мазков-отпечатков в окраске по Граму.

2.Бактериологический метод (основной): посев исследуемого материала на специальные среды с целью выделения и идентификации возбудителя.

3.ПЦР.

Специфическая профилактика: при ранениях и травмах – поливалент-

ная противогангренозная антитоксическая сыворотка (против C. perfringens, C.novii, C.septicum).

Специфическое лечение: поливалентная противогангренозная анти-

токсическая сыворотка (против C. perfringens, C.novii, C.septicum).

16

3. Характеристика возбудителя псевдомембранозного колита, микробиологическая диагностика.

Clostridium difficile – возбудитель энтерального клостридиоза (антибиотикоассоциированная диарея). Это острое инфекционное заболевание, проявляющееся симптомами токсикоза, диарейным синдромом с развитием псевдомем-

бранозного колита.

Морфо-тинкториальные свойства: грамположительные палочки с овальными субтерминальными спорами, перетрихи.

Чистая культура C.difficile. Окраска по Граму.

Культуральные свойства: облигатные анаэробы, растут на специальных питательных средах лучше в анаэробных условиях.

Факторы патогенности: токсин А (энтеротоксин) – вызывает диарею,

токсин В (цитотоксин) – нарушает функцию мембран и синтеза белка.

Патогенез и клиника: заболевание развивается, как правило, на фоне приема антибиотиков. Антибиотики, подавляя резидентную микробиоту кишечника, способствуют его колонизации C.difficile, который нередко является симбионтом этого биотопа. Бактерия синтезирует токсины, поражающие толстую кишку с образованием пленки из фибрина и слизи. Заболевание проявляется приступообразными болями в животе, диареей, повышенной температурой.

Пленки из фибрина на слизистой оболочке кишечника.

17

Микробиологическая диагностика. Материал на исследовании: фекалии

1.Бактериологический метод: выделяют на специальных средах чистую культуру, которую тестируют на токсигенность.

2.ПЦР.

3.ИФА (определение токсинов).

Специфическая профилактика и специфическая терапия не разработаны.

4.Характеристика возбудителя столбняка, специфическая профилактика и лечение.

Возбудитель столбняка – Clostridium tetani.

Морфо-тинкториальные свойства: грамположительная тонкая палочка, перитрих, капсулу не имеет. Спора круглой формы, больше диаметра клетки, располагается терминально и придает клетке сходство с барабанной палочкой.

Чистая культура C.tetani. Окраска по Граму.

Культуральные свойства: анаэробы, растут на соответствующих питательных средах.

Антигенная структура: О- и Н-антигены, по жгутиковому (Н) антигену выделяют 10 сероваров C.tetani.

Факторы патогенности: все серовары возбудителя продуцируют экзотоксин, состоящий из двух фракций: тетаноспазмин (нейротоксин) и тетанолизин. Основной фактор патогенности – тетаноспазмин, который блокирует все типы синаптического торможения. Тетанолизин обладает гемолитическим,

кардиотоксическим и летальным действием.

Заражение происходит при попадании спор возбудителя с почвой через поврежденные кожные покровы (небольшие царапины, ссадины, проколы на конечностях) и слизистые оболочки вследствие бытовых, производственных и

18

сельскохозяйственных травм. У новорожденных заражение происходит через пупочную ранку.

Патогенез: возбудитель размножается и остается в воротах инфекции (колотые раны). Клиника заболевания развивается только за счет экзотоксина, выделяемого возбудителем. Экзотоксин (тетаноспазмин) проникает в нервные клетки и посредством аксонного транспорта попадает в ЦНС. При этом развивается сначала местное, а затем и генерализованное подавление синаптического торможения на уровне двигательных нейронов, так как токсин препятствует выходу тормозных медиаторов в синаптическую щель. В связи с этим в мионевральных синапсах распространяются только процессы возбуждения. Это приводит к гипертонусу скелетных мышц больного и судорогам.

Клиника: симптомы столбняка развиваются по нисходящему типу (tetanus descendens) и начинаются со спазма жевательной мускулатуры (тризм), затем наступают судороги мимической мускулатуры. Позже судороги переходят на мышцы шеи, туловища и конечностей. Вследствие резкого сокращения мышц спины больной выгибается в виде дуги с опорой на затылок и пятки (опистотонус). Смерть чаще наступает от асфиксии из-за паралича мышц грудной клетки и диафрагмы.

Опистотонус. Картина сэра Чарлза Белла (шотландский физиолог и анатом, член Лондонского королевского общества).

Столбняк новорожденных (tetanus neonatorum). Протекает по типу гене-

рализованной инфекции. Вначале у ребенка нарушается акт сосания и глотания, а затем начинаются судороги. Вследствие резкого сокращения мышцсгибателей у ребенка отмечается характерная поза.

19

Микробиологическая диагностика направлена на обнаружение и опре-

деление типа токсина, а также выделение возбудителя.

Материал на исследование: кровь, фекалии, промывные воды желудка, рвотные массы, моча и остатки пищевых продуктов.

1. Определение типа ботулинового токсина:

Классический метод – реакция нейтрализации (РН) на белых мышах (см. учебно-методическое пособие «Учение об инфекции и иммунитете. Основы иммунологии»).

Экспресс-методы – РНГА по Рыцаю, ИФА.

2. Выделение возбудителя:

Бактериологический метод – посев исследуемого материала на соответствующие для анаэробов питательные среды.

Специфическое лечение: до установления типа токсина вводят полива-

лентную антитоксическую сыворотку типов A, B, E, после установления типа токсина – моновалентную антитоксическую сыворотку.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА.

1.Изучение схемы бактериологического исследования отечной жидкости при подозрении на газовую гангрену.

I этап исследования.

Посев исследуемого материала на регенерированные среды Китта-

Тароцци, Вильсона-Блера. Посевы инкубируют при 370С 24-48 часов. II этап исследования.

1.Изучение характера роста на питательных средах, приготовление мазков с окраской по Граму.

2.С целью выделения чистой культуры производят пересев со среды КиттаТароцци на кровяной агар Цейсслера. Посевы инкубируют при 370С 24

часа.

III этап исследования.

1.Изучение характера роста на среде Цейсслера.

2.С целью определения -токсина (лецитиназа) производят посев чистой культуры на желточный агар. Посевы инкубируют при 370С 24 часа.

IV этап исследования.

1.Учет роста на желточном агаре.

2.Вывод (определение вида выделенной культуры).

2.Световая микроскопия готовых препаратов чистых культур бактероидов, возбудителей газовой гангрены, столбняка, ботулизма в окраске по Граму.

22