
2 курс / Микробиология 1 кафедра / Экзамен микробик / metodichka_4
.pdfПлазмиды подразделяют на различные категории в зависимости от свойств, которые они кодируют у бактерий (таблица 7):
Таблица 7 – Классификация плазмид
Категории плазмид |
Свойства |
F-плазмида (от англ. fertility – |
Кодирует способность к переносу плазмид- |
плодовитость). |
ных и хромосомных генов при конъюгации |
|
бактерий через половые пили. |
R-плазмида (от англ. resis- |
Кодирует устойчивость бактерий к несколь- |
tance – противодействие) – |
ким антибиотикам и другим лекарственным |
плазмида резистентности. |
веществам. |
Плазмиды бактериоциноген- |
Кодируют синтез бактериоцинов (особых |
ности. |
белков), вызывающих гибель близкородст- |
|
венных бактерий. Например, бактериоцины |
|
E.coli вызывают гибель патогенных энтеро- |
|
бактерий. Бактериоцины могут быть полезны |
|
при лечении инфекций, вызванных антибио- |
|
тикорезистентными бактериями. |
Плазмиды патогенности. |
Кодируют синтез поверхностных бактериаль- |
|
ных антигенов, энтеротоксинов, гемолизинов |
|
и других факторов патогенности. |
Подвижные генетические элементы
Транспозоны – подвижные участки ДНК, которые способны перемещать-
ся внутри бактериальной хромосомы или между ДНК бактерий, плазмид и бак-
териофагов («прыгающие гены»). Помимо генов, кодирующих их перемещение по ДНК, транспозоны могут содержать структурные гены, обеспечивающие бактерию новыми свойствами (устойчивость к антибиотикам, токсинопродук-
ция и др).
Вставочные последовательности или инсерционные элементы (от англ. insertion sequens – вставочные последовательности) – простейший тип генети-
ческих элементов, мигрирующих между хромосомами, внутри хромосомы, ме-
жду хромосомой и плазмидами. Содержат гены, необходимые для их переме-
щения, новых свойств не кодируют.
8
Подвижные генетические элементы могут:
-распространять новые гены в популяции бактерий;
-координировать взаимодействие плазмид с хромосомой;
-вызывать изменения генов (мутацию, инактивацию) в местах их внедре-
ния в генетический материал.
Таким образом, внехромосомные молекулы ДНК бактериальной клетки способствуют разнообразным изменениям бактериального генома, появлению новых свойств и эволюционным изменениям микробной популяции в целом.
4. Виды генетической изменчивости. Использование генной инженерии в
медицине.
Мутации – это изменения последовательности нуклеотидов в бактериаль-
ной ДНК, которые ведут к изменению или утрате одного или нескольких фено-
типических признаков. Мутации у бактерий происходят с высокой частотой под влиянием очень многих внешних факторов, которые называются мутагена-
ми. Самые частые мутагены: УФ-, γ-лучи (физические), органические и неорга-
нические вещества (химические), транспозоны (биологические). Мутации бы-
вают: точечными (затрагивают один ген) и более протяженными (целый уча-
сток хромосомы). Они могут быть самопроизвольными и вызванными искусст-
венно. Мутации, которые приводят к возникновению новых полезных свойств,
обеспечивают выживаемость бактериальных популяции.
Генетические рекомбинации – это передача новых генов от одной клетки к другой с приобретением новых свойств, закодированных в этих генах. Гене-
тические рекомбинации отличаются друг от друга способом попадания в клетку новых генов. Виды генетических рекомбинаций: трансформация, конъюгация,
трансдукция, фаговая конверсия.
Трансформация у бактерий – форма генетической изменчивости, при ко-
торой бактерия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК погибшей бактерии-донора. Это приводит к образованию ре-
9

комбинантных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских кле-
ток (рисунок 10).
Рисунок 10 – Трансформация у бактерий (схема)
Впервые феномен трансформации был установлен Ф. Гриффитсом в
1928 г. на модели бескапсульного и капсульного пневмококков (рисунок 11).
Следует напомнить, что капсула пневмококков – мощный фактор патогенности,
способствующий возникновению септического течения инфекции и гибели ла-
бораторного животного. Для проведения опыта в качестве индикатора исполь-
зовали 3 белые мыши. Первую мышь заражали живыми, бескапсульными неви-
рулентными пневмококками. Второй мыши вводили убитую культуру капсуль-
ных вирулентных пневмококков; третьей мыши – смесь живых бескапсульных пневмококков и убитых капсульных пневмококков.
В результате из всех мышей, взятых в опыт, погибала третья мышь, т.к.
живые бескапсульные пневмококки поглощали фрагменты ДНК убитых кап-
сульных, приобретали ген, кодирующий синтез капсулы, превращались в виру-
лентные пневмококки и убивали мышь.
10

Рисунок 11 – Опыт Ф. Гриффитса по трансформации пневмококков
Конъюгация у бактерий – передача генетического (хромосомного и не-
хромосомного) материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при их непосредственном контакте (рисунок 12). Необходимым условием для конъю-
гации является наличие у бактерии-донора F-плазмиды, которая контролирует синтез половых pili на поверхности клеток-доноров.
а) |
б) |
Рисунок 12 – Конъюгация у бактерий (а – электронная микроскопия, б – схема)
Процесс конъюгации между бактерией-донором (F+) и бактерией-
реципиентом (F-) имеет следующие стадии:
установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых
pili;
11

прохождение генетического материала через канал половой pili от донора к реципиенту;
рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК.
F-плазмида может находиться как в автономном состоянии в цитоплазме,
так и в интегрированном с хромосомой клетки. Находясь в автономном состоя-
нии, она контролирует только собственный перенос при конъюгации. В резуль-
тате F- клетка превращается в F+ клетку, содержащую F-плазмиду. Если F-
плазмида интегрирована с хромосомой бактерии, то при конъюгации она кон-
тролирует не только собственный перенос, но и перенос части хромосомной ДНК в клетку-реципиент. С помощью интегрированной F-плазмиды частота переноса хромосомных генов между бактериями существенно возрастает.
Трансдукция и фаговая (лизогенная конверсия) у бактерий.
Трансдукция – перенос небольшого фрагмента хромосомной ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага (ри-
сунок 13). В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые фенотипические признаки (ферментативные свойства, устойчивость к антибио-
тикам и др.). При выходе бактериофага из клетки фрагмент донорской трансду-
цированной ДНК остается в хромосоме клетки-реципиента, следовательно, со-
храняются и новые фенотипические признаки. Таким образом, при трансдукции умеренный бактериофаг выполняет только транспортную функцию.
Рисунок 13 – Трансдукция у бактерий
12
Фаговая конверсия (от лат conversion – превращение) – получение бакте-
рией новых свойств в результате использования генов профага, интегрирован-
ного с хромосомой клетки. Например, ДНК умеренного дифтерийного фага со-
держит ген tox, который кодирует синтез дифтерийного экзотоксина. Если ДНК такого умеренного фага интегрирует с ДНК дифтерийной палочки, то она пре-
вращается в токсигенную, т.е. продуцирующую дифтерийный экзотоксин. При выходе из клетки умеренного фага дифтерийные бактерии утрачивают ген tox и
теряют способность к продукции экзотоксина. Лизогенная конверсия выявлена также у возбудителей ботулизма, холеры и др.
Использование генной инженерии в медицине
Получение живых вакцин. В основе лежит принцип аттенуации, предложен-
ный Л. Пастером. Аттенуация – ослабление вирулентности микробов под действием физических, химических или биологических факторов с сохране-
нием их иммуногенных свойств. Например, вакцинный штамм туберкулез-
ных бактерий (БЦЖ) был получен А.Ш. Кальметом и Ж-М.К. Жереном пу-
тем длительного (13 лет) выращивания возбудителя туберкулеза на пита-
тельной среде с желчью.
Получение генно-инженерных вакцин (рекомбинантная дрожжевая вакцина против вирусного гепатита В из протективного HBs-антигена вируса).
Разработка и внедрение в практику молекулярно-биологических методов ди-
агностики инфекционных заболеваний, например, ПЦР.
Получение штаммов бактерий и микроскопических грибов с высокой про-
дукцией антибиотиков.
Получение инсулина, гормонов, интерферона и других биологических ве-
ществ в бактериальных клетках с помощью генно-инженерных методов.
13

5. Антибиотики. Классификация антибиотиков по механизму антимикроб-
ного действия.
Антибиотики – это химические вещества биологического происхождения,
а также их полусинтетические и синтетические аналоги, обладающие бактерио-
статическим или бактерицидным действием.
Антибиотики, обладающие бактериостатическим действием, подавляют рост и размножение микроорганизмов. Антибиотики, обладающие бактери-
цидным действием, вызывают гибель микроорганизмов.
Антибиотики были открыты английским ученым А. Флемингом и амери-
канским ученым С. Ваксманом. В 1929 г. А. Флеминг установил, что фильтрат бульонной культуры плесневого гриба Penicillium notatum содержит вещество
(пенициллин), угнетающее рост стафилококков. Однако, в чистом виде препа-
рат был получен лишь в 1940 г., после чего было налажено его промышленное производство. С. Ваксман открыл в 1944 г. стрептомицин (его продуцентом яв-
ляется Actinomyces griseus) и предложил впервые термин «антибиотик» (от греч. anti, bios – против жизни). В настоящее время существует более 6 тысяч природных антибиотиков и созданы многие десятки тысяч полусинтетических и синтетических препаратов.
А. Флеминг |
З.А. Ваксман |
14
Антибиотики могут вырабатывать клетки животного (лизоцим) и расти-
тельного происхождения (фитонциды чеснока и лука), однако широкого произ-
водственного применения в медицине они не имеют.
Основными источниками получения природных и полусинтетических
антибиотиков являются:
-плесневые грибы родов Penicillium и Cephalosporium – синтезируют бета-
лактамные антибиотики (пенициллины и цефалоспорины);
-актиномицеты (ветвящиеся бактерии) – синтезируют большинство (80%)
природных антибиотиков, в том числе стрептомицин, ванкомицин, нистатин и др.;
-бактерии (бациллы, псевдомонады и др.).
Группы антибиотиков по химической структуре:
бета-лактамные (пенициллины, цефалоспорины, монобактамы, карбапенемы);
макролиды;
производные диоксиаминофенилпропана (левомицетин);
тетрациклины;
аминогликозиды;
спектиномицин;
полимиксины;
гликопептиды;
липопептиды;
ансамицины (рифампицин);
полиеновые антибиотики;
антибиотики других химических групп.
15
Синтетические противомикробные химиотерапевтические препараты.
Методами химического синтеза созданы вещества, которые не встречаются в живой природе, но похожи на антибиотики по механизму и спектру действия.
К наиболее значимым группам относят:
1.сульфаниламиды (производные сульфаниловой кислоты);
2.хинолоны;
3.нитрофураны;
4.8-оксихинолины;
5.производные хиноксалина;
6.5-нитроимидазолы
7.оксазолидиноны.
В бактериальной клетке есть четыре основные области, которые отличают-
ся от клеток человека и определяют клиническую эффективность действия ан-
тибактериальных препаратов: клеточная стенка, рибосомы, нуклеиновые
кислоты и цитоплазматическая мембрана.
По механизму действия антибиотики подразделяют:
1. Бактерицидные:
нарушают синтез клеточной стенки или ее компонентов (бетa-лактамы,
фосфомицин, ристомицин);
нарушают морфо-функциональную организацию цитоплазматической мембраны (полимиксины, полиены);
нарушают репликацию ДНК (фторхинолоны).
2. Бактериостатические:
ингибируют синтез белка на уровне РНК-полимеразы (рифампицины);
ингибируют синтез белка на уровне рибосом (тетрациклины, левомице-
тин, фузидин, макролиды и др.).
16

Антибиотики могут быть узкого спектра (действуют только на грамотри-
цательные бактерии или на некоторые виды грамположительных бактерий), а
также широкого спектра (действуют на грамположительные и грамотрица-
тельные бактерии).
Существуют специальные группы антибиотиков: противотуберкулез-
ные, противогрибковые и др.
Нерациональное применение антимикробных лекарственных средств для лечения инфекционных заболеваний нередко приводит к формированию лекар-
ственной устойчивости – антибиотикорезистентности. Бактерии следует счи-
тать резистентными, если они не обезвреживаются оптимальными терапевтиче-
скими дозами препарата, вводимого в организм. Резистентность может быть
природной и приобретенной. Приобретенная лекарственная резистентность связана с адаптацией микроорганизмов к условиям окружающей среды. Про-
блема формирования и распространения лекарственной резистентности микро-
бов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых госпи-
тальными микробами с множественной лекарственной устойчивостью к не-
скольким антибиотикам (так называемая полирезистентность).
6.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
Осложнения и последствия антибиотикотерапии.
Метод серийных разведений. В пробирках готовят двукратные разведе-
ния антибиотиков, а затем к каждому разведению добавляют взвесь исследуе-
мых бактерий. После термостатирования в течение суток при 370С определяют минимальную подавляющую концентрацию антибиотика (МПК), т.е самую низкую концентрацию препарата, которая полностью задерживает рост бакте-
рий (рисунок 14).
17