1 курс / Биология / Практические / 12 / Bio_12_otvety_k_sam

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1.Виды современных молекулярно-генетических исследований. Их значение для медицины.

2.Рестрикция ДНК.

3.Секвенирование. Разнообразие SNP (снипы)

4.Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

5.Понятие таргетной терапии, как одного из видов молекулярной медицины.

6.Биоинформационные подходы в геномике. Геномные базы данных человека.

7.Базы данных для поиска геномных маркеров (GenBank National Center for Biotechnology Information; OMIM - On-line Mendelian Inheritance in Man и т.д.)

ВОПРОС 1. Виды современных молекулярно-генетических исследований. Их значение для медицины.

Молекулярно-генетические методы (методы ДНК –диагностики) – это большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК. ДНКметоды используются в следующих направлениях:

1.Для диагностики моногенных и мультифакториальных наследственных болезней.

2.Для пренатальной диагностики моногенных болезней или пола плода (в случаях Х – сцепленного наследования).

3.В судебной медицине для идентификации личности (геномная дактилоскопия) и установления родства.

4.Для диагностики инфекционных заболеваний.

5.Для диагностики онкологических заболеваний.

Возможности диагностики связаны с осуществлением программы «Геном человека». Перечень моногенных болезней, диагностируемых молекулярными методами, и доступных пренатальной диагностике: муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна-Беккера, гемофилия (А и В), фенилкетонурия, болезнь Хантера (мукополисахаридоз), адрено – генитальный синдром , хорея Гентингтона, синдром фрагильной Х- хромосомы и др.

Различают прямые и косвенные методы ДНК-диагностики. Первые применяются, если известны: ген, ответственный за развитие соответствующего наследственного заболевания, основные типы его патологических (патогенных) мутаций - в случае муковисцидоза наиболее частая (мажорная) мутация.

Косвенные методы ДНК-диагностики наследственных (прежде всего, моногенных) болезней (в общем виде молекулярно-генетические методы генетического анализа людей - см. здесь же, выше) основаны на идентификации не патологических (патогенных) мутаций генов непосредственно, а на анализе наличия в геноме и поведения (распределение аллелей генетического маркера в геномах родственников: у сибсов, в парах «дед-внук», «дядяплемянник») в семье обследуемого так называемых полиморфных генетических маркеров - участков (ло-кусов) ДНК, тесно сцепленных в соответствующем районе конкретной хромосомы с локусом, ответственным за генетическое заболевание. На настоящий момент на хромосомах человека картировано порядка 6 тыс. таких ДНК-маркеров (полиморфных генных локусов). Для некоторых из них доказана ассоциация с конкретным наследственным или мульти-факторным заболеванием. Так, аллель В27 генетической системы HLA ассоциирован с «анкилозирующим спондилитом» и «псориатическим спондилитом», аллель DR3 названной системы - с болезнью Аддисона и с рассеянным склерозом, аллель DR4 - с ревматоидным артритом, аллель CW6 - с псориазом. Применение косвенных методов ДНК-диагностики возможно при отсутствии полной информации о «проблемном» гене (он не идентифицирован и поэтому не известен порядок следования в нем нуклеотидных последовательностей, т.е. ген не секвенирован). Необходимо, однако, знать, на какой хромосоме этот ген расположен.

ВОПРОС 2 Рестрикция ДНК.

Рестрикцией ДНК (латинское restrictio – ограничение) называется процесс ферментативного разделения цепочек дезоксирибонуклеиновой кислоты на отдельные фрагменты, представляющие собой последовательность нуклеотидов различного размера.

Этот процесс является частью одного из важнейших внутриклеточных защитных механизмов от проникновения и встраивания в геном чужеродного генетического материала. Он контролируется сложной системой клеточной регуляции. Другой стороной применения этого явления является

синтетическая генная инженерия, которую нельзя было бы вообразить без возможности разделять ДНК-материал на фрагменты.

Механизм действия

Специфичность

Все эндогенные рестриктазы высокоспецифичны. Они четко распознают определенную цепочку нуклеотидов, но могут «разрезать» её по-разному. Как правило, узнается короткая последовательность из 4 — 6 оснований.

Особенностью процесса рестрикции-модификации является защита собственной ДНК от сайт-специфичной эндодезоксирибонуклеазы (рестриктазы) с помощью метилирования. Этот процесс осуществляется ферментами метилазами, также действующими избирательно к азотистым основаниям, расположенным в определенном порядке, и добавляющими к ним метильные группы, делая сайт молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты устойчивым к рестрикции.

Группы рестриктаз

Выделяют три особенных класса рестриктаз. Они отличаются по нескольким признакам: строению, точкам применения.

Рестриктазы первого класса разрезают молекулы генетического материала в произвольных точках, а ферменты второго и третьего классов — в строго определенных. При этом эндорестриктазы второго класса действуют в пределах одного сайта, а третьего — рядом с сайтом узнавания.

Рестриктазы второго класса имеют отдельную двухбелковую структуру, отличаясь от первого и третьего классов со сложным строением и АТФзависимостью, что позволяет использовать их для генной инженерии. Фермент второго класса состоит из двух действующих частиц: рестриктирующей эндонуклеазы, модифицирующей метилазы, которые действуют только вместе с ионами магния.

Благодаря достижениям молекулярной биохимии, ученые смогли выделить более пятисот специфичных рестриктаз второго класса. Но как выяснилось по ходу исследований, некоторые из них действуют на одинаковые последовательности нуклеотидов. Такие ферменты получили название — изошизомеры. Истинные изошизомеры делят сайт ДНК по одной точке, а

гетерошизомеры, выбирая одинаковый сайт, осуществляют рестрикцию в разных его местах.

Как уже было указано, рестриктазы чаще выделяют последовательность из 4 или 6 азотистых оснований, а потому, в зависимости от количества, делятся на мелко- и крупнощемящие.

Механизм действия

Эндогенная рестриктаза распознает определенную последовательность ДНК

— сайт узнавания. В большинстве случаев он является палиндромом, то есть порядок расположения нуклеотидов одинаков при чтении справа налево и слева направо. Например, 3′-AGATCT-5′ или 5′-TCTAGA-3′.

Фермент прочно связывается с узнанным рядом азотистых оснований, а затем при движении цепочек молекулы «находит» сайт разрезания.

Рестрикция возможна с образованием тупых (blunt) и липких (sticky) концов. Тупые концы образуются, если рестриктаза делит цепочки ДНК друг напротив друга. А липкие концы характеризуются образованием коротких и длинных хвостов (3′-, 5′-концов) из-за несимметричного разрезания палиндромов. Липкие концы самокомплементарны, то есть способны восстановить структуру при соединении.

Необходимость изучения механизмов рестрикции

Изучение процессов рестрикции существенно упростило исследовательскую деятельность, так как с ее помощью стало возможным разделение единицы генетического материала на небольшие части.

С помощью физических методов (электрофорез с агарозой) фрагменты можно разделить по размеру, а затем изучить каждый в отдельности, построив рестрикционные карты.

Практическое применение в медицине и генетике

Если несколько упростить и схематично отобразить алгоритм действий генной инженерии, то мы получим следующее: сначала необходимо выделить исходную информацию из исследуемого материала, затем разделить её на части, последовательности, потом объединить, синтезировать различные фрагменты воедино для возникновения новой структуры генетической информации, обладающей заданными характеристиками, и в последующем ввести новый материал другому организму.

Расщепление ДНК (рестрикция) является основой генетической инженерии и находит своё применение во множестве ежедневно проводимых исследований. На основе нуклеотидных последовательностей, полученных при разделении цепочек различных молекул, создаются искусственные рекомбинантные ДНК, которые находят широкое применение во многих отраслях человеческой жизни. Значительное количество научных работ посвящены исследованию возможности лечения таких непобедимых на сегодня заболеваний как ВИЧ-инфекция, опухоли и пр. Например, путём присоединения к генам, кодирующим белки-рецепторы заражённых вирусом клеток, другого гена, который способствует синтезу растительного яда, нарушается процесс биосинтеза белка в цитоплазме, что ведет к их гибели. В перспективе могут быть найдены подходы к лечению множества наследственных врожденных и приобретённых заболеваний, причем на самом раннем этапе — на молекулярном, субмолекулярном уровнях.

Известны исследования в области фармацевтики, улучшающие характеристики производимых лекарств и способы их доставки к клеткам, тканям организма. Сделала крупные шаги вперед трансплантология, позволяя выращивать донорские органы в различных животных или даже просто в пробирках с питательными средами, при этом исключая энзимную несовместимость благодаря генной модификации.

ВОПРОС 3 Секвенирование. Разнообразие SNP (снипы)

Секвенирование ДНК - определение последовательности четырех химических структурных блоков - так называемых «азотистых оснований» -

которые составляют молекулу ДНК.

Процесс, используемый для секвенирования ДНК, известен как метод обрыва цепи или метод Сэнгера. Он основан на модифицированной форме полимеразной цепной реакции.

Метод обрыва цепи (секвенирование по Сэнгеру)

Наряду с нуклеотидами и полимеразой, используемой в стандартном процессе ПЦР, подготовленная для реакции обрыва цепи среда содержит кроме четырех обычных нуклеотидов ДНК также и варианты каждого из них, так называемые дидезоксинуклеотиды.

Эти дидезоксинуклеотиды похожи на правильные нуклеотиды ДНК, но не содержат 3'-гидроксильной группы.

После того как дидезоксинуклеотид присоединен к растущей цепочке ДНК, ДНК-полимераза не может добавлять никаких других нуклеотидов. Таким образом, процесс репликации прекращается и полученный фрагмент ДНК прерывается.

Репликационная среда содержит только небольшое количество дидезоксинуклеотидных вариантов каждого из четырех нуклеотидов ДНК.

Во время прохождения полимеразной цепной реакции существует высокая вероятность того, что фермент полимеразы добавит немодифицированный нуклеотид к растущей цепи и что процесс репликации будет продолжаться. Но иногда полимераза связывает дидезоксинуклеотид с цепью и реакция прекращается.

В суспензии, содержащей миллиарды фрагментов ДНК, конечным

результатом является серия фрагментов, заканчивающихся одним из четырех дидезоксинуклеотидов.

Все вместе эти фрагменты представляют собой все возможные расположения нуклеотидов A, C, G и T на синтезируемой нити.

Каждый из четырех вариантов дидезоксинуклеотида возможно пометить разными маркерами (например, красителем, который испускает свет с определенной длиной волны в ультрафиолетовом свете) для того, чтобы сделать различные нуклеотиды легко идентифицируемыми.

Поскольку фрагменты разделяются по длине и массе во время гельэлектрофореза, маркеры указывают каким нуклеотидом заканчивается каждый фрагмент. Затем гель можно считывать снизу вверх для идентификации нуклеотидной последовательности.

Этот этап обычно включает в себя использование автоматического секвенатора ДНК, который ускоряет процесс считывания.

Метод секвенирования по Сэнгеру может быть использован для того, чтобы определить за одну реакцию последовательность ДНК образца, содержащего до одной тысячи пар оснований.

Этапы секвенирования больших геномов

Секвенирование большого генома включает в себя следующие три основных этапа:

1. Картирование генома.

Весь геном сначала случайно разбивается на более мелкие последовательности ДНК - приблизительно от 100 000 до 300 000 пар оснований.

Повторяя этот цикл несколько раз, исследователи получают серию перекрывающихся ВАС.

Затем эти ВАС пропускают через гель-электрофорез, чтобы определить их индивидуальные фингерпринты ДНК. Изучив структуру этих паттернов, исследователи могут определить исходный порядок ВАС в геноме.

2. Секвенирование ДНК.

После того как исходный порядок ВАС был картирован, каждый ВАС разбивается рестрикционными эндонуклеазами на гораздо более мелкие фрагменты, которые могут быть секвенированы с использованием реакции обрыва цепи.

Этот этап секвенирования иногда называют BAC-BAC секвенирование.

3. Анализ результатов.

Паттерн перекрывающихся последовательностей ДНК используется для определения порядка фрагментов в каждом ВАС.

В этой процедуре используется несколько различных компьютерных программ, которые могут анализировать последовательности ДНК.

Секвенирование целого генома (метод дробовика, шотган-

секвенирование, shotgun sequencing)

Этот метод полностью пропускает стадию картирования генома.

Вместо этого весь геном разбивается на случайные фрагменты сначала около 2000, а затем около 1000 пар оснований.

(Наличие фрагментов различной длины помогает сделать сборку нуклеотидных последовательностей более точной.)

Эти фрагменты, которые насчитывают миллионы, затем секвенируются и анализируются, после чего определяются нуклеотидные последовательности, соответствующие каждой из хромосомам.

Все это делается с помощью мощных компьютеров и сложных программ.

Секвенирование следующего поколения (высокопроизводительное секвенирование) (Next-generation sequencing, high-throughput sequencing)

Секвенирование следующего поколения (NGS) - это термин, используемый для описания ряда различных современных технологий секвенирования которые включают:

1.Illumina (Solexa) sequencing

2.Roche 454 sequencing

3.Ion torrent: Proton / PGM sequencing

4.SOLiD sequencing

Платформы NGS выполняют массовое параллельное секвенирование, в ходе которого миллионы фрагментов ДНК из одного образца секвенируются одновременно.

Технология массового параллельного секвенирования обеспечивает высокопроизводительное секвенирование, что позволяет секвенировать весь геном менее чем за один день.

В последнее десятилетие были разработаны несколько платформ NGS, которые обеспечивают недорогое и высокопроизводительное секвенирование.

ВОПРОС 4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В настоящее время приоритетная роль в качестве основы ДНК-диагностики переходит к методу ПЦР (Полимеразная Цепная Реакция), или PCR (англ. Polymerase Chain Reaction). Названный метод дает возможность в условиях in vitro в течение 1 ч получить миллионы копий заданного (представляющего интерес для исследователя или врача) фрагмента молекулы (нуклеотидной последовательности) ДНК, использование которых благодаря их многочисленности существенно облегчает идентификацию в геноме пациента (пробанда) сайта ДНК, представляющего диагностический интерес. Популярность метода ПЦР в медицинской среде объясняется также тем, что он широко используется в целях высокоточной и надежной диагностики вирусных (СПИД, вирусные гепатиты) и инфекционных заболеваний по выявлению нуклеиновой кислоты возбудителя. Альтернативным методу ПЦР, уступающим ему позиции в качестве основы

ДНК-диагностики, является метод блот-гибридизации (от англ. bϊot - пятно, клякса; blotting paper - промокашка, фильтровальная бумага). В арсенале молекулярных и медицинских генетиков этот метод появился раньше метода ПЦР. Технически он более сложен, требует использования радиоактивных материалов. В настоящее время его модификации применяются для решения ряда конкретных задач - гибридизация ДНК-зондов с разделенными с помощью электрофореза молекулами РНК, а также с белковыми молекулами, фиксируемыми на фильтрах с мечеными антителами.

5. Понятие таргетной терапии, как одного из видов молекулярной медицины.

Современный термин таргетная терапия (от англ. target - мишень подразумевает избирательное воздействие на опухолевые клетки-мишени или отдельные патогенетические механизмы развития болезни. При таргетной терапии используют лекарственные препараты, которые блокируют рост и распространение клеток определенного типа рака. Они воздействуют на специфические молекулы, которые принимают участие в онкогенезе (процесс, посредством которого нормальные клетки превращаются в раковые) и росте опухоли. Рост и деление нормальных клеток в основном находятся под контролем ряда химических и молекулярных сигналов, которые дают указания клеткам. Генетические изменения могут расстроить этот процесс, после чего клетки перестают нормально расти и делиться, и не умирают в положенное время. [4]

Развитию опухоли способствуют изменения двух типов генов:

Протоонкогены - это нормальные гены, которые участвуют в процессе роста и деления клеток. Изменения в этих генах ведут к образованию онкогенов, которые способствуют и допускают излишний, продолжительный рост и деление клеток.

Подавляющие опухоль гены - это нормальные гены, которые замедляют рост и деление клеток. Когда подавляющий опухоль ген не функционирует должным образом, клетки не могут перестать расти и делиться, что приводит к росту опухоли. Методы целевой терапии рака различными способами влияют на рост и деление раковых клеток во время развития, роста и распространения рака. Многие из этих методов сосредоточены на белках, которые участвуют в сигнальных процессах. Блокируя сигналы, которые

дают раковым клеткам указание неконтролируемо делиться и расти, методы целевой терапии могут помочь остановить рост и деление раковых клеток. [5]

Целевая таргетная терапия может быть эффективнее и безопаснее для нормальных клеток, чем обычная химиотерапия, поскольку она сосредоточена на молекулярных и клеточных изменениях, характерных для данного типа рака. В последние десять лет FDA одобрило большое количество новых целевых препаратов для лечения рака. Тем не менее, у целевой терапии имеются некоторые ограничения. Главным из них является возможность клеток вырабатывать устойчивость к препаратам. В большинстве случаев нет другой таргетной терапии для таких случаев и пациенту рекомендуют вернуться к традиционным методам лечения - химио- и радиотерапии. Именно по этой причине таргетную терапию назначают в комплексе с стандартными методами лечения.

Работа таргетной терапии начинается с определения целей, которые будут поражаться агентами, и которые имеют решающее значение для роста раковых клеток и их выживания. Это делается путем измерения уровней протеина в раковых клетках в сравнении со здоровыми клетками.

Потенциальными целями таргетной терапии являются белки, которые в большом количестве присутствуют в раковых клетках (но не в здоровых), особенно, если заранее известно, что они способствуют росту раковых клеток и их выживанию. Таргетная терапия нацелена на поиск этих белков, блокировку их функций или полное разрушение.

Сегодня используется большое количество таргетных терапий рака, среди них выделяют: гормональные терапии, ингибиторы сигнальной трансдукции, модуляторы экспрессии генов, индукторы апоптоза, ингибиторы ангиогенеза, иммунотерапии, молекулы доставки токсина. [1]

На сегодняшнее время одобрены такие способы воздействия на раковые опухоли:

1. Гормональные методы лечения. Они замедляют или останавливают часть опухолей, которые требуют особых гормонов, путем вмешательства в их структуру. Используются для лечения рака молочной железы и рака простаты.

2. Ингибиторы сигнала трансдукции. Блокируют деятельность молекул, которые участвуют в процессе ответа клетки на сигналы окружающей среды. Это процесс биохимических реакций, на которые реагирует