Иллюстрационное пособие по общей микробиологии

341

полученную рекомбинантную молекулу ДНК вводят в подходящую клеткуреципиент. Таким образом, при конструировании рекомбинантной молекулы ДНК можно выделить следующие этапы:

1.Подбор вектора – молекулы ДНК, способной к репликации в клетке.

2.Выделение интересующих генов из ДНК клетки - донора.

3.Создание рекомбинантной генетической конструкции:

3.1.Разрезание (рестрикция) ДНК донора и ДНК вектора специфическими ферментами – рестриктазами (генетическими ножницами).

3.2.Соединение (лигирование) ДНК донора и ДНК вектора с помощью специфических ферментов - лигаз.

4. Введение полученной рекомбинантной молекулы ДНК в реципиентную

клетку.

5. Отбор и идентификация клеток, экспрессирующих введенный ген.

В качестве вектора используют плазмиды, фаги или вирусы. Вектор должен содержать маркерные гены, которые придают клетке – реципиенту новые свойства, позволяющие отличить генетически измененную бактериальную клетку от исходных клеток. Чаще всего в качестве вектора применяют R-плазмиды, так как они позволяют проводить селекцию генетически измененных бактерий по признаку

устойчивостиКлонированиек антиб отикам. Схема полученияфрагментаи клонированияДНКчужеродного гена в бактериальной клетке представлена на рисунке 10.54.

Вектор (фаг, плазмида, вирус)

Рисунок 10.54 - Схема получения рекомбинантной молекулы ДНК и клонирования чужеродного гена в бактериальной клетке.

При конструировании рекомбинантной ДНК используют специфические ферменты – рестриктазы и лигазы. Рестрикционные эндонуклеазы или рестриктазы узнают и расщепляют определенные последовательности ДНК, специфические для каждого фермента по длине и структуре (рисунок 10.55).

342

Рисунок 10.55 – Схема расщепления ДНК рестриктазами EcoRI и HindIII.

К настоящему времени из различных микроорганизмов выделено более тысячи рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используется около 200 рестриктаз. Одни рестриктазы разрезают ДНК по оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие - со сдвигом, с образованием “ступеньки”. В первом случае образуются так называемые “тупые” концы ДНК, а во втором – “липкие” концы, то есть фрагменты ДНК имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки. Липкие концы могут быть на 5'-конце (фосфатные концы) и на 3'-конце (гидроксильные концы).

ДНК-лигазы – это ферменты, соединяющие (сшивающие) фрагменты ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Сшивание фрагментов ДНК осуществляется по “липким” концам или с помощью искусственно достроенных

Рисунок 10.56 – Рестрикция и лигирование ДНК. Заимствовано из Интернетресурсов.

Сшивание фрагментов ДНК по “липким” концам происходит в результате спаривания оснований за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов. При отсутствии комплементарных “липких” концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, используя так называемые линкеры (переходники) - короткие участки ДНК, имеющие разные “липкие” концы. Сшивание фрагментов по “тупым” концам также возможно, однако этот процесс представляет определенные трудности.

Отделение бактерий, получивших рекомбинантную ДНК, от общей массы клеток называется клонированием. Для клонирования бактериальную суспензию

343

высевают на плотную питательную среду с селективным агентом - например, с антибиотиком (рисунок 10.57).

Бактериальная суспензия

Рисунок 10.57 – Клонирование и отбор рекомбинантных клеток. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Рекомбинантные клетки можно идентифицировать также по синтезируемому ими продукту. Для этого в питательную среду вносят вещества, реагирующие с синтезируемым продуктом и проявляющие видимую реакцию (например, преципитирующую сыворотку).

Используя приемы генетической инженерии, возможно переносить гены как между родственными бактериями, так и между бактериями разных видов и родов. Генная инженерия позволяет получать новые препараты медицинского назначения. Так, в практике широко используется генно-инженерная вакцина против гепатита В, в состав которой входит антиген вируса гепатита В, синтезированный в клетках дрожжей. Налажен выпуск генно-инженерного инсулина, производимого с помощью дрожжевых клеток или клеток кишечной палочки. В медицине применяются полученные генно-инженерными методами интерлейкины-1, 2, 3, 6, фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды и другие препараты. Организмы, полученные с помощью генной инженерии, называются генномодифицированными или трансгенными организмами (ГМО или ТГО). Технология, основанная на использовании генетически модифицированных организмов,

называется ГМО-технологией.

Достижения генной инженерии широко использует биотехнология для получения антибиотиков, витаминов, аминокислот, вакцин, моноклональных антител, диагностикумов и других продуктов. Производство этих препаратов с использованием микробиологического синтеза более выгодно, чем химическим путем. Например, одна микробная клетка синтезирует около ста тысяч молекул белка в минуту. Органический синтез не обладает такой высокой производительностью.

344

10.4.Вопросы для контроля усвоения материала

1.Дайте определение генетике бактерий.

2.Что представляет собой геном бактериальной клетки?

3.Что такое плазмиды?

4.Какие плазмиды Вы знаете?

5.Охарактеризуйте IS-элементы и транспозоны.

6.Расскажите о строении ДНК.

7.Что такое генотип и фенотип?

8.Расскажите о фенотипической изменчивости.

9.Назовите формы генотипической изменчивости.

10.Расскажите о мутациях бактерий и их проявлениях.

11.Назовите виды рекомбинаций.

12.Расскажите о трансформации у бактерий.

13.Что такое трансдукция?

14.Назовите виды трансдукции.

15.Расскажите о конъюгации у бактерий.

16. Расскажите о принципах генной инженерии.

10.5.Тренировочные тесты

1.Наука о наследственности и изменчивости организмов называется (один правильный ответ):

1.1.иммунологией

1.2.физиологией

1.3.морфологией

1.4.генетикой

1.5.экологией

2.Геном бактерий включает (несколько правильных ответов):

2.1.нуклеоид

2.2.цитоплазматическую мембрану

2.3.плазмиды

2.4.мобильные элементы

2.5.рибосомы

3.Совокупность генов бактериальной клетки называется (один правильный ответ):

3.1.плазмидой

3.2.транспозоном

3.3.генотипом

3.4.фенотипом

3.5.мобильными элементами

4.Генетический материал в бактериальной клетке содержится (несколько правильных ответов):

345

4.1.в цитоплазматической мембране

4.2.в клеточной стенке

4.3.в плазмидах

4.4.в геноме

4.5.в капсулах

5.К внехромосомным факторам наследственности бактерий относятся (один правильный ответ):

5.1.митохондрии

5.2.плазмиды

5.3.рибосомы

5.4.мезосомы

5.5.включения

6.Плазмиды могут определять следующие свойства бактерий (несколько правильных ответов):

6.1.выработка бактериоцинов

6.2.выработка конститутивных ферментов

6.3.множественная лекарственная устойчивость

6.4.способность к конъюгации

6.5.спорообразование

7.F-плазмиды обусловливают (один правильный ответ):

7.1.трансформацию

7.2.образование половых пилей

7.3.синтез энтеротоксинов

7.4.устойчивость к антибиотикам

7.5.синтез колицинов

8.R-плазмиды обусловливают (один правильный ответ):

8.1.образование половых пилей

8.2.синтез энтеротоксинов

8.3.устойчивость к антибиотикам

8.4.синтез колицинов

8.5.спорообразование

9.Ent-плазмиды обусловливают (один правильный ответ):

9.1.синтез гемолизина

9.2.образование половых пилей

9.3.синтез энтеротоксинов

9.4.устойчивость к антибиотикам

9.5.синтез колицинов

10.Col-плазмиды обусловливают (один правильный ответ):

10.1.утилизацию глюкозы

10.2.синтез гемолизина

347

16.4.фенотипические

16.5.модификационные

17.Возможные механизмы формирования мутаций у бактерий (несколько правильных ответов):

17.1.трансформация

17.2.дупликация

17.3.инверсия

17.4.трансдукция

17.5.транслокация

18.В качестве мутагенов могут выступать (несколько правильных ответов):

18.1.бактериофаги

18.2.УФЛ

18.3.ионизирующее излучение

18.4.физиологический раствор

18.5.химические вещества

19.Формы генотипической изменчивости бактерий (несколько правильных ответов):

19.1.диссоциация

19.2.мутации

19.3.рекомбинации

19.4.полиморфизм

19.5.адаптация

20.Конъюгация – это передача (один правильный ответ):

20.1.изолированного фрагмента ДНК от клетки-донора клетке-реципиенту

20.2.ДНК от клетки-донора в клетку-реципиент через конъюгационный мостик

20.3.ДНК от одних бактерий другим посредством фага

20.4.ДНК с помощью R-плазмид

20.5.R-плазмид от донора реципиенту

21.Способность к конъюгации связана с наличием на поверхности бактерий (один правильный ответ):

21.1.гемагглютинина

21.2.жгутиков

21.3.капсулы

21.4.пилей общего типа

21.5.секс-пилей (пилей 2-го порядка)

22.Трансформация – это передача (несколько правильных ответов):

22.1.изолированного фрагмента хромосомной ДНК от клетки-донора клеткереципиенту

22.2.ДНК от клетки-донора в клетку-реципиент через конъюгационный мостик

22.3.ДНК от одних бактерий другим посредством умеренного фага

348

22.4.ДНК от одних бактерий другим посредством вирулентного фага

22.5.изолированной плазмидной ДНК от клетки-донора в клетку-реципиент

23. Трансдукция - это передача (один правильный ответ):

23.1.изолированной плазмидной ДНК от клетки-донора клетке-реципиенту

23.2.изолированной хромосомной ДНК от клетки-донора клетке-реципиенту

23.3.ДНК от клетки-донора клетке-реципиенту через конъюгационный мостик

23.4.ДНК от одних бактерий другим посредством умеренного фага

23.5.ДНК от одних бактерий другим с помощью R-плазмид

24.Виды трансдукции (несколько правильных ответов):

24.1.адаптивная

24.2.абортивная

24.3.фенотипическая

24.4.неспецифическая

24.5.специфическая

25.Проявлением фенотипической изменчивости бактерий является (один правильный ответ):

25.1.бактериоциногения

25.2.спорообразование

25.3.транзиция

25.4.адаптация

25.5.подвижность

26.Виды репараций (несколько правильных ответов):

26.1.спонтанные

26.2.индуцированные

26.3.темновая

26.4.световая

26.5.рекомбинантная

27.Мутации бывают (несколько правильных ответов):

27.1.генные

27.2.хромосомные

27.3.точковые

27.4.обратные

27.5.темновые

28.Мутации в зависимости от вызываемых в клетке последствий делятся на (несколько правильных ответов):

28.1.неспецифические

28.2.нейтральные

28.3.специфические

28.4.условно-летальные

28.5.летальные

349

29. Транзиция – это (несколько правильных ответов):

29.1.замена пурина на пиримидин

29.2.замена пиримидина на пурин

29.3.замена пиримидина на пиримидин

29.4.замена пурина на пурин

29.5.перенос ДНК из одной клетки в другую с помощью фагов

30.Трансверсия – это (один правильный ответ):

30.1.замена пурина на пиримидин

30.2.замена пиримидина на пиримидин

30.3.замена пурина на пурин

30.4.перенос ДНК из одной клетки в другую с помощью фагов

30.5.перенос ДНК из одной клетку в другую с помощью F-плазмид

31.Процесс восстановления поврежденной клеточной ДНК называется (один правильный ответ):

31.1.конъюгацией

31.2.репарацией

31.3.трансформацией

31.4.трансдукцией

31.5.мутацией

Правильные ответы: 1.4, 2.1, 2.3, 2.4, 3.3, 4.3, 4.4, 5.2, 6.1, 6.3, 6.4, 7.2, 8.3, 9.3, 10.5, 11.2, 12.2, 13.2, 13.3, 14.2, 14.3, 15.4, 16.1, 16.2, 17.2, 17.3, 17.5, 18.2, 18.3, 18.5, 19.2, 19.3, 20.2, 21.5, 22.1, 22.5, 23.4, 24.2, 24.4, 24.5, 25.4, 26.3, 26.4, 27.1, 27.2, 27.3, 27.4, 28.2, 28.4, 28.5, 29.3, 29.4, 30.1, 31.2.

350

11. Экология микробов

11.1.Распространение и роль микробов в природе

Вприроде микробы распространены повсеместно. Взаимоотношения микроорганизмов между собой и с окружающей средой изучает экология (греч. oikos – жилище, logos – понятие, учение). Этот термин предложил в 1866 году Э. Геккель. Основной единицей в экологии является экосистема – биологическая система, состоящая из сообщества живых организмов (биоценоз), среды их обитания (биотоп) и системы связей, осуществляющей обмен между ними. В экосистему входят как биотические, так и абиотические компоненты (рисунок 11.1).

Продуценты (растения)

Редуценты (бактерии и грибы)

Рисунок 11.1 – Строение экосистемы.

Биотические компоненты составляют сообщество организмов или

биоценоз той ли иной системы. Под абиотическими компонентами следует понимать физические и химические условия экосистемы, в которой живут организмы. Размеры микробных экосистем очень разнообразны. В качестве микробных экосистем могут выступать организм человека или животных, пруд, озеро, корневая система дерева. Возможны и такие экосистемы, как ротовая полость или участок кишечника.

Естественными средами обитания большинства микроорганизмов являются почва, вода и воздух. Применительно к человеку средами обитания микробов является организм человека в целом или его отдельные системы (зоны обитания) – пищеварительная, дыхательная, мочеполовая системы. В этих зонах обитания микроорганизмы образуют микробные сообщества или микробиоценозы. Каждое микробное сообщество в конкретном биоценозе образуют специфичные

аутохтонные микроорганизмы (греч. autos – свой, chthon – страна), которые обычно в них встречаются. В природных биоценозах (почва, вода, воздух) выживают и размножаются лишь те микроорганизмы, для которых условия окружающей среды (температура, влажность, кислотность и другие факторы)